Agarose-Gelelektrophorese, ihre Funktionsweise und ihre Verwendung

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Einfache Gesetze der Physik besagen, dass, wenn Strom an ein Medium angelegt wird, das geladene Spezies enthält, diese Spezies in Richtung der entgegengesetzten Ladung wandern. Abhängig vom Medium, durch das sie sich bewegen, können andere Merkmale – wie etwa die Größe der vorhandenen Arten – ihre Bewegung beeinflussen und zur Trennung führen. Auf dieser Grundlage basieren Elektrophoresetechniken wie die Agarosegelelektrophorese – Techniken, die in den Biowissenschaften weit verbreitet sind.

In diesem Artikel werden wir untersuchen, wie die Agarosegelelektrophorese funktioniert, wie sie interpretiert werden kann und welche Zwecke sie verfolgt.

Elektrophorese ist eine Technik, die elektrischen Strom nutzt, um DNA, RNA oder Proteine ​​anhand ihrer physikalischen Eigenschaften wie Größe und Ladung zu trennen.

Die Agarosegelelektrophorese ist eine Form der Elektrophorese, die zur Trennung von Nukleinsäurefragmenten (DNA oder RNA) anhand ihrer Größe verwendet wird. Negativ geladene DNA/RNA wandert durch die Poren eines Agarosegels zum positiv geladenen Ende des Gels, wenn elektrischer Strom angelegt wird, wobei kleinere Fragmente schneller wandern. Die resultierenden Banden können dann mit ultraviolettem (UV) Licht sichtbar gemacht werden.

RNA1 neigt jedoch dazu, Sekundärstrukturen zu bilden – manchmal mehrere verschiedene Arten für dasselbe Fragment –, die die Art und Weise beeinflussen, wie sie wandert. Folglich stellen die beobachteten Bänder nicht immer ihre wahre Größe dar und die Bilder sind verschwommen. Native Agarosegele (bei denen die Bedingungen die natürlichen Strukturen der Analyten nicht stören) werden daher in der Regel nicht für die Analyse der RNA-Größen verwendet, obwohl sie eine Schätzung der Menge und Integrität liefern können. Zu den Alternativen gehören Northern Blot und denaturierende Agarosegelelektrophorese2, bei denen Bedingungen verwendet werden, die in der Lage sind, Sekundärstrukturen aufzubrechen.

Agarosegele können auch zur Trennung von Proteinen3 nach ihrer Größe und Ladung verwendet werden (im Gegensatz zu DNA/RNA variiert die Ladung von Proteinen je nach den eingebauten Aminosäuren). Aufgrund der großen Porengrößen in Agarosegelen werden Proteine ​​jedoch häufig auf Polyacrylamidgelen aufgetrennt, die stattdessen kleinere Poren haben, was eine höhere Auflösung für kleine Proteinmoleküle bietet.

Daher konzentrieren wir uns im weiteren Verlauf dieses Artikels auf die DNA-Agarose-Gelelektrophorese.

Agarose ist ein Bestandteil von Agar. Es bildet eine 3D-Gelmatrix aus helikalen Agarosemolekülen in supergewundenen Bündeln, die durch Wasserstoffbrückenbindungen gehalten werden, mit Kanälen und Poren, durch die Moleküle passieren können. Beim Erhitzen brechen diese Wasserstoffbrückenbindungen auf, wodurch die Agarose flüssig wird und in eine Form gegossen werden kann, bevor sie sich zurücksetzt (Abbildung 1).

Der in einem Gel enthaltene Agaroseanteil beeinflusst die Porengröße und damit die Größe der Moleküle, die passieren können, und die Geschwindigkeit, mit der sie dies tun. Je höher der Anteil an Agarose, desto kleiner ist die Porengröße, desto kleiner sind also die Moleküle, die passieren können, und desto langsamer ist die Wanderung. Im molekularbiologischen Labor wird für alltägliche DNA-Trennungen typischerweise 0,7–1 %iges Agarosegel verwendet, das eine gute und klare Differenzierung von Fragmenten im Bereich von 0,2–10 kb ermöglicht. Größere Fragmente können mit Gelen mit geringerem Prozentsatz aufgelöst werden, sie werden jedoch sehr zerbrechlich und schwer zu handhaben, während Gele mit höherem Prozentsatz eine bessere Auflösung kleinerer Fragmente ermöglichen, aber spröde sind und möglicherweise ungleichmäßig aushärten.

Die Gelelektrophorese wird zur Trennung von Gemischen aus Biomakromolekülen wie DNA, RNA und Proteinen eingesetzt. Diese Technik trennt nach Molekülgröße und/oder Ladung. Dies wird erreicht, indem Moleküle mithilfe eines elektrischen Felds durch ein Gel gezogen werden, das winzige Poren enthält.

Da DNA mit bloßem Auge nicht sichtbar ist, wird beim Aushärten ein interkalierender Farbstoff wie Ethidiumbromid (EtBr) in das Gel eingearbeitet. Dadurch wird die DNA gebunden und unter UV-Licht fluoresziert, sodass die DNA-Fragmente sichtbar gemacht werden können. Je mehr DNA vorhanden ist, desto heller ist die Bande.

Mit einem Ladefarbstoff gemischte Proben werden an einem Ende des Gels platziert, das in Laufpuffer eingetaucht ist. Anschließend wird über Elektroden an jedem Ende des Geltanks ein elektrischer Strom durch das Gel geleitet (Abbildung 2).

Wenn die Proben weit genug gelaufen sind, um eine ausreichende Trennung zu erreichen, wird das Gel aus dem Tank entnommen und auf eine UV-Lichtbox gelegt. Der interkalierende Farbstoff ermöglicht dann die Visualisierung der Probenbanden und die Bestimmung ihrer Größe im Vergleich zu einer DNA-Leiter mit bekannten Bandengrößen. Die Beziehung zwischen Migrationsentfernung und Fragmentgröße ist nicht linear, was die Einbeziehung von Größenmarkierungen als Leitfaden noch wichtiger macht (Abbildung 3).

Bei der Auswahl, Einrichtung, Durchführung und Analyse von Agarosegelen sind eine Reihe wichtiger Schritte4 erforderlich, die wir nun betrachten werden.

1. Bestimmen Sie den erforderlichen Gelprozentsatz – 0,7–1 % Agarosegel sind in der Regel für die meisten Anwendungen ausreichend, es ist jedoch wichtig, einen Prozentsatz zu wählen, der für Ihre Proben und erwarteten Fragmentgrößen geeignet ist. Kombinieren Sie das Agarosepulver mit dem gleichen Puffertyp, der auch für das Gel verwendet wird, und erhitzen Sie es, um die Mischung zu schmelzen. Vermeiden Sie dabei ein Sieden. Tris-Acetat-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (TAE) oder Tris-Borat-EDTA (TBE)5 sind oft die Puffer der Wahl, da Tris-Säure-Lösungen wirksame Puffer für leicht basische Bedingungen sind und die DNA deprotoniert und wasserlöslich halten. Das EDTA, ein Chelatbildner, inaktiviert Nukleasen, die die zu analysierende DNA schädigen können.

2. Gießen Sie ein Gel – Wählen Sie eine Gelgussform und einen Kamm in der gewünschten Größe und stellen Sie eine ausreichende Anzahl von Vertiefungen für alle Proben und Leiter sowie eine Vertiefungskapazität bereit, um die Menge jeder zu ladenden Probe aufzunehmen. Befestigen Sie die offenen Enden der Form mit einem Gussrahmen oder Klebeband, um das Gel während des Aushärtens festzuhalten. Fügen Sie DNA-Interkalationsfarbstoff in den Boden der Form hinzu – für EtBr werden normalerweise 0,2–0,5 µg/ml verwendet. Der Nachweis, dass EtBr ein Mutagen ist, wird derzeit noch diskutiert, aber viele Labore sind daher auf Alternativen6 wie GelRed umgestiegen. Fügen Sie das Gel hinzu, achten Sie darauf, die Form nicht zu überfüllen, und stellen Sie sicher, dass der interkalierende Farbstoff gleichmäßig vermischt ist. Gießen Sie das Gel nicht zu heiß ein, da sich die Form sonst verziehen oder zerbrechen könnte.

3. Proben/Leitern mit Ladefarbstoff mischen – Ladefarbstoffe erfüllen mehrere Funktionen. Sie ermöglichen es dem Benutzer zu sehen, wo sich seine ansonsten farblose Probe befindet, was das genaue Pipettieren der Probe in die Vertiefung erleichtert und so die Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination von Proben zwischen den Vertiefungen verringert. Wenn das Gel läuft, wandert der Farbstoff mit der Probe, sodass der Benutzer erkennen kann, wo im Gel die Probe angekommen ist, und verhindert, dass sie zu weit läuft und im Puffer verloren geht. DNA-Proben ohne Ladefarbstoff neigen auch dazu, sich beim Laden im Laufpuffer zu verteilen, da sie weniger dicht sind. Die meisten Ladefarbstoffe enthalten daher Glycerin oder Ficoll, wodurch die Probe-Farbstoff-Mischung dichter wird und sich am Boden der Vertiefungen absetzt. Bromphenolblau ist ein beliebter Farbstoff, einige enthalten jedoch auch zusätzliche Farbstoffe wie Xylolcyanol. Während Farbstoffe gekauft werden können, entscheiden sich viele Labore dafür, ihre eigenen Farbstoffe herzustellen.7

Wenn Sie sehr kleine Probenmengen verwenden (z. B. weniger als 5 µl), kann es von Vorteil sein, zu diesem Zeitpunkt etwas Wasser hinzuzufügen, um die effektive und gleichmäßige Beladung der Gelvertiefungen zu erleichtern. Wenn Sie davon ausgehen, dass die DNA-Konzentration in einigen Proben viel höher ist als in anderen, kann es auch in diesem Stadium erforderlich sein, Ihrer Proben-Farbstoff-Mischung aus diesen konzentrierten Proben Wasser hinzuzufügen. Wenn Sie dies nicht tun, kann das starke Signal dieser Bänder während der Visualisierung schwächere Bänder überdecken oder es erforderlich machen, dass die starken Bänder überbelichtet werden, um die schwächeren sichtbar zu machen, wodurch helle, verzerrte Bereiche auf dem Gelbild entstehen.

4. Laden Sie das Gel – Entfernen Sie den Gussrahmen/das Klebeband vom ausgehärteten Gel und legen Sie es in den Geltank. Achten Sie dabei darauf, dass sich die Vertiefungen am negativen Ende befinden (schwarze Elektroden). Füllen Sie den Tank mit Laufpuffer (TAE oder TBE), sodass das Gel eingetaucht ist. Entfernen Sie vorsichtig den Kamm und pipettieren Sie die Proben-Farbstoff-Mischung (und ggf. Wasser) vorsichtig in die Vertiefungen. Versuchen Sie zu vermeiden, die Ränder der Vertiefungen mit der Pipettenspitze zu berühren, da diese zerbrechen und eine Probe in die nächste laufen könnte. Eine Überlastung von Brunnen kann zum gleichen Ergebnis führen. Große DNA-Mengen können auch die DNA-Migration beim Laufen verlangsamen. Laden Sie Markierungsleitern, vorzugsweise eine an jedem Ende der Probenreihe. Gele verlaufen möglicherweise nicht immer in einer perfekt geraden Linie. Wenn Sie also an jedem Ende eine Leiter haben, können Sie die Größe der vorhandenen Fragmente leichter bestimmen. Es sind verschiedene Leitern mit unterschiedlichen angegebenen Größen erhältlich. Wählen Sie eines aus, das für die erwarteten Fragmentgrößen am besten geeignet ist.

5. Lassen Sie das Gel laufen – Setzen Sie den Deckel mit den Elektroden schwarz auf schwarz und rot auf rot auf den Tank und schließen Sie die Elektroden an ein Netzteil an, ebenfalls schwarz auf schwarz und rot auf rot. Dies bildet zusammen mit dem Geltank das Gelelektrophoresegerät. Stellen Sie sicher, dass die Elektroden und der Deckel richtig herum angebracht sind, da Ihre Proben sonst rückwärts aus den Vertiefungen in den Laufpuffer laufen. Stellen Sie die Zeit und Spannung ein, mit der Ihr Gel laufen soll; 120 V für 35 Minuten sind ein guter Näherungswert, dieser sollte jedoch auf den verwendeten Gelanteil und die erwarteten Fragmentgrößen zugeschnitten werden, um eine gute elektrische Trennung zu erreichen. Das Anlegen von Strom an ein Agarosegel führt dazu, dass es sich erwärmt. Je höher die Spannung, desto mehr erwärmt es sich. Wenn also Gele mit geringem Prozentsatz verwendet werden, ist es ratsam, niedrigere Spannungen zu verwenden, um ein Schmelzen zu verhindern. Es kann verlockend sein, die Spannung zu erhöhen, damit ein Gel schneller läuft. Dies kann jedoch zu „Smiley-Gelen“ führen, bei denen die Bänder an jedem Ende nach oben gebogen sind, was es schwierig macht, die richtige Bandgröße zu bestimmen. Hier begann das Gel leicht zu schmelzen, wodurch die Bänder ungleichmäßig verlaufen. Dies kann auch dazu führen, dass die Bänder verschmiert und schlecht definiert erscheinen.

6. Visualisierung – Sobald die Proben den größten Teil des Gels hinuntergelaufen sind (die Farbstofffront macht dies sichtbar), schalten Sie das Netzteil aus. Tragen Sie Handschuhe, entfernen Sie das Gel in der Form vorsichtig aus dem Tank, lassen Sie überschüssigen Laufpuffer abtropfen und übertragen Sie es zur Visualisierung in eine UV-Box in einem geeigneten Behälter. Wechseln Sie die Handschuhe, um eine Kontamination der umgebenden Oberflächen, Türgriffe usw. mit interkalierendem Farbstoff aus dem Gel oder Laufpuffer zu verhindern. Wenn DNA-Fragmente für nachgelagerte Anwendungen benötigt werden, können die entsprechenden Banden vorsichtig mit einer Skalpellklinge aus dem Gel herausgeschnitten werden, während man sie in einem dunklen Raum auf eine UV-Lichtbox legt. Stellen Sie sicher, dass Sie einen UV-Gesichtsschutz tragen und die Haut bedeckt halten, während die Lichtbox eingeschaltet ist, um Schäden an Ihrer Haut oder Ihren Augen durch das UV-Licht zu vermeiden.

Agarosegele können auf einer UV-Lichtbox in einem dunklen Raum oder mit einer eigenständigen Lichtbox, die mit einer Kamera verbunden ist, sichtbar gemacht werden. Welches System auch immer verwendet wird, UV-Licht wird von unten durch das Gel gestrahlt und DNA-Banden fluoreszieren dank des daran gebundenen interkalierenden Farbstoffs. Dies kann mit einer Kamera mit einem speziellen UV-Filter für Ihre Aufzeichnungen erfasst werden. Markierungsleitern werden mit einer Anleitung geliefert, die die Größe der einzelnen Bänder angibt. Durch den Vergleich mit Banden in Probenspuren kann daher die Größe der Banden bestimmt werden. Auch die relative DNA-Menge zwischen den Proben kann verglichen werden, da höhere DNA-Konzentrationen hellere Banden erzeugen. Ein Beispiel ist in Abbildung 4 dargestellt.

Es gibt eine Reihe von Gründen, warum die Trennung von DNA-Fragmenten wünschenswert sein kann, von denen viele in allen Disziplinen der Biowissenschaften weit verbreitet sind. Betrachten wir einige allgemeine Zwecke.

Begriff

Definition

Agarose-Gelelektrophorese

Eine Form der Elektrophorese zur Trennung von Makromolekülen, beispielsweise DNA-Fragmenten, in einer Agarosematrix.

Chelatbildner

Eine chemische Verbindung, die mit Metallionen reagiert und stabile, wasserlösliche Metallkomplexe bildet.

Denaturierende Agarosegele

Agarosegele laufen unter Bedingungen, die die natürliche Struktur von DNA, RNA oder Proteinen zerstören und so zu deren Entfaltung führen.

Deprotonierung

Entfernung eines Protons (H+).

DNA-Leiter/Markerleiter

Eine Lösung aus DNA-Fragmenten bekannter Größe, die zur Extrapolation der Fragmentgrößen in unbekannten Proben verwendet werden kann.

Elektrische Trennung

Die Trennung von Biomolekülen wie DNA, RNA oder Proteinen nach ihrer Größe und/oder Ladung mittels elektrischem Strom.

Elektrophorese

Eine Technik, die elektrischen Strom nutzt, um DNA, RNA oder Proteine ​​anhand ihrer physikalischen Eigenschaften wie Größe und Ladung zu trennen.

Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (EMSA)

EMSAs, auch Gel-Shift-Assays genannt, sind eine auf Elektrophorese basierende Technik zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Nukleinsäuren.

Gelelektrophoresegerät

Ausrüstung zur Durchführung der Gelelektrophorese, die normalerweise aus einem Geltank und einem Netzteil mit Anschlusselektroden besteht.

Interkalierender Farbstoff

Farbstoffe, die doppelsträngige DNA binden und so deren Sichtbarmachung unter UV-Licht ermöglichen.

Farbstoff wird geladen

Ein Farbstoff zur Vorbereitung von DNA-Leitern und Proben für die Elektrophorese, der es ermöglicht, sie mit bloßem Auge zu erkennen und ihre Dichte zu erhöhen, um eine Dispersion zu verhindern.

Mutagen

Ein chemisches oder physikalisches Phänomen, das Fehler bei der DNA-Replikation begünstigt.

Native Agarosegele

Agarosegele laufen unter Bedingungen, die den Erhalt der natürlichen Struktur von Biomolekülen wie DNA, RNA oder Proteinen ermöglichen.

Northern-Blot

Eine Technik zum Nachweis spezifischer RNA-Sequenzen in einer Probe, bei der Elektrophorese zur Probentrennung eingesetzt wird.

Nukleasen

Enzyme, die Nukleinsäuren wie DNA oder RNA spalten.

Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Eine Form der Elektrophorese zur Trennung von Makromolekülen wie Nukleinsäuren und Proteinen in einer polymerisierten Acrylamidmatrix.

Einschränkung der Verdauung

Ein Prozess, bei dem Enzyme verwendet werden, um DNA an bestimmten Stellen entsprechend der umgebenden DNA-Sequenz zu schneiden.

Laufpuffer

Der Puffer wird zum Füllen des Tanks verwendet, in den das Gel eingetaucht ist und laufen gelassen wird. Es hilft, stabile Bedingungen aufrechtzuerhalten.

Sekundärstruktur

Die 3D-Struktur, die ein Polypeptid oder Polynukleotid annimmt und die durch elektrostatische Anziehung zwischen benachbarten Resten entsteht.

Southern-Blot

Eine Technik zum Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen in einer Probe, bei der Elektrophorese zur Probentrennung eingesetzt wird.

Transkriptionsfaktoren

Proteine, die am Prozess der Umwandlung oder Transkription von DNA in RNA beteiligt sind.

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KorrekturIn dem Artikel wurde fälschlicherweise angegeben, dass die positive Elektrode die Kathode sei. Dies wurde am 13. Februar 2023 aktualisiert, um die Anode korrekt als positive Elektrode zu identifizieren.