Maschinelles Lernen unterscheidet P2X7

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12673 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Adenosintriphosphat (ATP) ist ein extrazelluläres Signalmolekül, das hauptsächlich die pathophysiologische Situation im Körper beeinflusst und von purinergen Rezeptoren, einschließlich ionotropem P2X7, wahrgenommen werden kann. Neuronale Stammzellen (NSCs) verbleiben im neuronalen Gewebe erwachsener Menschen und können über die Aktivierung durch hervorgerufene pathophysiologische Situationen zu physiologischen Prozessen beitragen. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass vom Menschen induzierte pluripotente, aus Stammzellen stammende NSCs (iNSCs) die Fähigkeit zur ATP-Erkennung hauptsächlich über den purinergen und ionotropen Rezeptor P2X7 besitzen. Als nächstes haben wir zur Entwicklung eines auf maschinellem Lernen (ML) basierenden Screeningsystems für aus Lebensmitteln gewonnene neuronale Wirkstoffe und deren wirksame Dosen ATP-ausgelöste Kalziumreaktionen von iNSCs gesammelt, die mit mehreren Substanzen und Dosen vorbehandelt wurden. Schließlich haben wir herausgefunden, dass ML mit zusammengesetzten Bildern durchgeführt wurde, die jeweils neun Wellenformbilder enthielten, um ein besseres ML-Modell (MLM) mit höherer Präzision zu erhalten. Unser MLM kann subtile, nicht identifizierte Änderungen in Wellenformen, die von vorbehandelten iNSCs mit jeder Substanz und/oder Dosis erzeugt werden, korrekt in die positive Gruppe einordnen, wobei häufige mRNA-Expressionsänderungen zu den Signaturen der Genontologie gehören.

Das Gehirn gilt als das komplexeste und flexibelste Organ des Körpers. Die Entwicklung des neuronalen Netzwerks im fötalen Gehirn kann durch Chemikalien beeinträchtigt werden, die die Plazentaschranke passieren1,2. Nach der Geburt wächst das menschliche Gehirn weiter und entwickelt funktionelle neuronale Netzwerke, die externe Stimulation als sinnvolle Informationen empfangen. Allerdings kann eine postnatale Exposition gegenüber neurotoxischen Substanzen wie polychloriertem Biphenyl negative Auswirkungen auf die geistige und motorische Entwicklung haben3. Selbst im erwachsenen Gehirn müssen etablierte essentielle neuronale Netzwerke erhalten bleiben und neue Netzwerke müssen bis zum Tod entwickelt werden4. Jüngste Studien haben gezeigt, dass das Gehirn eines erwachsenen Menschen neurale Stammzellen (NSCs) für die De-novo-Neurogenese zur Regeneration und/oder zum Aufbau neuer Netzwerke enthält5. Um ein Gleichgewicht zwischen Homöostase und Veränderungen in neuronalen Netzwerken aufrechtzuerhalten, ist es notwendig, die wirksamen neuronalen Dosen von Substanzen zu untersuchen, die in den Körper aufgenommen werden.

Nahrungsmittel und Getränke sind die häufigsten Quellen für Nährstoffe und neuronale Substanzen, darunter Neurotoxine6. In modernen Industrieländern kommen mehrere neue Lebensmittel und Nahrungsergänzungsmittel auf den Markt, deren Einnahmeerfahrung bisher schlecht ist. Beispielsweise können Sibutramin-haltige Schlankheitspräparate schwere gesundheitliche Probleme verursachen7. Zusätzlich zu reinen Neurotoxinen ist es wichtig, die wirksamen Dosen täglicher Lebensmittel zu kennen, die Substanzen enthalten, die Neuronen beeinflussen, wie Koffein, Alkohol und Theanin.

Neuronale Wirkungen wurden hauptsächlich an Tieren getestet. Um jedoch Bedenken hinsichtlich des Tierschutzes auszuräumen, müssen alternative Methoden zur Vorhersage der Neurotoxizität entwickelt werden. Vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) sind eine ideale Ressource für toxikologische Screening-Systeme, da sie verschiedene Arten neuronaler Zellen mit weniger ethischen Problemen bereitstellen können. Viele Berichte haben gezeigt, dass von hiPSC abgeleitete Neuronen für die Bewertung und Charakterisierung der Neurotoxizität spezifischer Substanzen im Zusammenhang mit Zelltod oder Synaptogenese nützlich sind8,9. Bisher ist jedoch kein Screeningsystem in der Lage, allgemeine Lebensmittelinhaltsstoffe dosisabhängig in Gruppen mit oder ohne neuronale Wirkung einzuteilen.

Adenosintriphosphat (ATP) ist der wichtigste purinerge Botenstoff, der als Hinweis auf Hirnschäden dient10. Die ATP-Konzentration spiegelt die Schwere der Schädigung wider, da die geschädigten Zellen ATP unkontrolliert freisetzen. Extrazelluläres ATP kann durch die Induktion des direkten neuronalen Zelltods und mikroglialer Entzündungsreaktionen zu einem Zyklus „schadeninduzierter Schäden“ führen11. ATP wird von purinergen Rezeptoren erfasst, von denen P2X7 in großem Umfang in erregbaren Zellen exprimiert wird, einschließlich neuronaler Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen, Astrozyten, Mikroglia-ähnlichen Zellen und Neuronen12. Die Funktionalität von P2X7 in menschlichen iNSCs bleibt jedoch unklar.

P2X7 ist ein ionotroper Rezeptor. Wenn es durch ATP aktiviert wird, öffnet es einen größeren Kationenkanal, der Kalium-, Natrium- und Calciumionen durchdringt und nicht andere Subtypen13. Daher wird angenommen, dass P2X7 eine wichtige Rolle bei pathologischen Zuständen wie Zelltod, Entzündungen und erregenden Nervenschäden spielt. Die ionotrope P2X7-Aktivierung in Neuronen verursacht Kalziumfunken mit den Eigenschaften hoher Frequenz, spitz zulaufender hoher Stärke und kurzer Dauer, die sich charakteristisch und mechanistisch von Kalziumwellen unterscheiden14. Calciumfunken können durch P2X7-gesteuerte Membranpotentialänderungen verursacht werden, die direkt spannungsgesteuerte Calciumkanäle vom L-Typ aktivieren, gefolgt von der Aktivierung der Calcium-induzierten Calciumfreisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum über die Aktivierung des Ryanodinrezeptorkanals.

Maschinelles Lernen ist im Bereich der medizinischen Diagnostik weit verbreitet. Allerdings bleibt seine Anwendung auf toxikologische Screening-Systeme als Ersatz für In-vitro- und In-vivo-Tests eine Herausforderung. Kowalczewski et al.15 berichteten, dass ein maschinelles Lernmodell die Reaktionen von hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten auf repräsentative arrhythmogene Wirkstoffe, Isoproterenol, Verapamil und Cisaprid, basierend auf bekannten Calciumwellenparametern unterscheiden kann. Monzel et al.16 haben ein maschinelles Lernmodell entwickelt, das zwischen mit dem dopaminergen neuronenspezifischen Toxin 6-Hydroxydopamin behandelten, von hiPSC abgeleiteten neuronalen Organoiden unterscheiden kann.

In dieser Studie haben wir bestätigt, dass funktionelles P2X7 in vom Menschen induzierten pluripotenten NSCs (iNSCs) aus Stammzellen exprimiert wird, und haben die Wirkung einer Vorbehandlung mit bekannten neurotoxischen und dosisabhängigen neuronal wirksamen Verbindungen durch globales mRNA-Expressionsprofil untersucht. Als Nächstes haben wir mithilfe einer neuen Methodik ein Modell für maschinelles Lernen (ML) entwickelt, das Rohbilder von Kalziumfunken verwendet, die undefinierte potenzielle Auswirkungen durch chemische Behandlung enthalten. Das entwickelte ML-Modell konnte Intratest-Gruppendaten genau in neuronal wirksame oder nicht/weniger neuronal wirksame Gruppen aufteilen und nicht gebildete neuronal wirksame Verbindungen erfolgreich als Mitglieder der neuronal wirksamen Gruppe vorhersagen.

Wir haben die gesamte Studie wie in Abb. 1 dargestellt entworfen. Aus der Literatur haben wir hochwirksame Konzentrationen als hohe Dosen und weniger wirksame Konzentrationen als niedrige Dosen für neuronale Zellen ermittelt17,18,19,20. Die zur Behandlung verwendeten Konzentrationen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Schematische Darstellung des gesamten Studiendesigns und -ziels.

Wir haben die erfolgreiche Differenzierung von hiPSCs in iNSCs bestätigt, indem wir die Expression von Nestin, einem neuronalen Stammzellmarkerprotein, auf mRNA- und Proteinebene nachgewiesen haben (Abb. 2a). Als nächstes bestätigten wir die P2X7-Expression auf mRNA- und Proteinebene durch quantitative PCR, Western Blot und Immunfluoreszenzfärbung (Abb. 2a, ergänzende Abb. 1). Wir haben auch bestätigt, dass iNSCs andere purinerge Rezeptor-mRNAs sowohl in der P2X- als auch in der P2Y-Familie exprimieren (ergänzende Abbildung 2). Der durch ATP induzierte Kalziumfunke wurde durch die Zugabe von 20 μM Brilliant Blue G (BBG), einem P2X7-spezifischen Antagonisten, vollständig gehemmt (Abb. 2b, Zusatzfilme 1 und 2). Wir beobachteten eine Verringerung der Anzahl der auf Kalzium reagierenden Zellen um etwa 83 % und eine Verringerung der Häufigkeit um etwa 83 % durch BBG (Abb. 2B). Bitte beachten Sie, dass aufgrund der Blockade des ionotropen Signals von P2X7 durch BBG nur Kalziumwellen erkannt wurden. Wir haben die Bedeutung von P2X7 in ATP-induzierten Calciumfunken weiter bestätigt, indem wir einen anderen P2X7-spezifischen Antagonisten, JNJ-4796556712,25,26, und einen Inhibitor, AZD905627, verwendet haben (ergänzende Abbildung 3).

Bestätigung der Expression von funktionellem P2X7 in iNSCs. (a) Bestätigung der Expression von Nestin und P2X7 auf mRNA- und Proteinebene. Maßstabsbalken, 100 μm; und 30 μm Einschub. (b) Hemmwirkung des P2X7-spezifischen Antagonisten Brilliant Blue G auf ATP-induzierte Calciumfunken. Dargestellt sind repräsentative Kalziumfunken der vier Zellen. Der Zellanteil der Calcium-Response-positiven Zellen und deren Signalfrequenzen werden in Balkendiagrammen angezeigt.

Wir haben Koffein dosisabhängig als eine bekannte neuronal wirksame Substanz ausgewählt. Als repräsentative starke neuronale Substanz wurde Valproinsäure ausgewählt. Darüber hinaus analysierten wir die Auswirkungen von Haloperidol auf die globale Genexpression, und die RNA-Sequenzierung der nächsten Generation ergab, dass jede Behandlung ein Expressionsmerkmal aufwies (Abb. 3a). Wir beobachteten bei allen Vergleichen im Vergleich zur Kontrolle sowohl eine Hoch- als auch eine Herunterregulierung der Gene (Abb. 3b). Die Genlisten mit Expressionsänderungen um mehr als das 5-fache log2 in jedem Vergleich sind in der Ergänzungstabelle 1a, b aufgeführt. Bitte beachten Sie, dass es keinen offensichtlichen Unterschied in der Anzahl der veränderten Gene zwischen den Behandlungen mit niedrigem und hohem Koffeingehalt gab. Durch eine Anreicherungsanalyse der statistischen Genontologie (GO) stellten wir jedoch fest, dass die Kategorien „passive Transmembrantransportaktivität“ und „Kanalaktivität“ in allen positiven Gruppen häufig geändert wurden, jedoch nicht in der Gruppe mit niedrig dosiertem Koffein (Abb. 3c). .

Veränderungen der Genexpression und gemeinsame Signaturen in der positiven Gruppe. (a) Heatmap der Genexpression in iNSCs, die mit keinem (orange), koffeinarmem (rosa), hohem Koffeingehalt (blau), Valproinsäure (grün) und Haloperidol (gelb) behandelt wurden. (b) Vulkandiagramme unterschiedlich exprimierter Gene in RNA-seq im Vergleich zu keinem gegenüber Koffein-niedrigem, Koffein-hohem Gen-Wert, Valproinsäure und Haloperidol. (c) Diagramm der Genontologie-Anreicherungsanalyse. Rich-Faktor: das Verhältnis der Anzahl der Zielgene dividiert durch die Anzahl aller Gene in jedem Term. Padj: p-Wert mit mehreren Testkorrekturen.

Wir haben zunächst die Sammlungen einzelner 1162- oder 1034-Wellenformen erhalten, die aus den Wellenformbeständen der negativen oder positiven Gruppe ausgewählt wurden (mit Ausnahme der Wellenformen der Haloperidol-Behandlung). Als nächstes demonstrierten wir jeden ML anhand jeder einzelnen Wellenform aus dem Jahr 1970, die zufällig aus den Wellenformbeständen ausgewählt wurde. Um das entwickelte MLM zu bewerten, haben wir die Präzision und den Rückruf anhand von 226 neuen Wellenformen getestet, die zufällig aus dem Bestand ausgewählt wurden. Als Ergebnis erreichten wir eine durchschnittliche Präzision von etwa 81 % (Abb. 4a). Um sicherzustellen, dass sich ML auf sinnvolle Unterschiede ohne menschliche Datenauswahl konzentriert, haben wir als Nächstes neun zufällig ausgewählte (Bildwiederverwendungen werden nicht berücksichtigt) Wellenformen aus jeder Gruppe in einem zusammengesetzten Bild kombiniert und dann ML anhand von 1162 zusammengesetzten Bildern demonstriert. Als Ergebnis erreichten wir eine durchschnittliche Präzision von etwa 99 % (Abb. 4b). Um die potenzielle Anwendbarkeit dieses MLM (MLM-1 genannt) zu bestätigen, haben wir außerdem nicht-informierte, mit Haloperidol behandelte Kalziumwellenformen herausgefordert und festgestellt, dass 74 % der Wellenformen in die positive Gruppe aufgeteilt werden konnten (Abb. 4c). Um die Breite der Anwendbarkeit des MLM-1 weiter zu untersuchen, behandelten wir neu hergestellte iNSCs aus dem gefrorenen Bestand mit Docosahexaensäure (DHA) und Gamma-Aminobuttersäure (GABA) und ermittelten deren Calciumwellenformen. Dem MLM-1 gelang es, GABA in die positive Gruppe einzuteilen, es gelang ihm jedoch nicht, die korrekte Vorhersage für DHA zu treffen (Daten nicht gezeigt). Um die Zellchargenabhängigkeit von MLMs zu untersuchen, führten wir einen Kreuzvorhersagetest durch, indem wir zuvor erhaltene Wellenformen aus verschiedenen Chargen von iNSCs, die aus denselben Stammbeständen stammten, in Frage stellten. Dabei stellten wir fest, dass MLM-1 einige der Wellenformen nicht korrekt trennen konnte (Daten nicht gezeigt). . Als nächstes kultivierten wir neu iNSCs aus Master-Beständen, erhielten alle Substanzen und dosisbehandelten Wellenformen und führten ein neues ML mit zusammengesetzten Bildern durch. Dieses neue MLM (mit dem Namen MLM-2) erreichte eine durchschnittliche Präzision von etwa 89 % und schaffte es, mit Haloperidol und DHA behandelte Wellenformen mit einer Genauigkeit von 85 % bzw. 59 % in die positive Gruppe zu unterteilen; Im Fall von GABA schlug dies jedoch fehl (nur 23 % der Wellenformen wurden in die positive Gruppe aufgeteilt) (ergänzende Abbildung 4). Um weiter zu untersuchen, ob ML die Erkennung allgemeiner Parameter diskriminiert, führten wir statistische Analysen von Wellenformen durch und verglichen negative und positive Gruppen hinsichtlich Spitzenfrequenz und Dynamikbereich. Wir konnten keine signifikanten Unterschiede in diesen Parametern feststellen (Ergänzende Abbildung 5a, b). Um darüber hinaus mechanistische Einblicke in die hohe Erkennungsfähigkeit unserer neuen ML-Methode zu erhalten, führten wir ML mit intensiv ausgewählten schwachen Signalwellenformen durch. Das entwickelte MLM-3, das mit einzelnen 703-Wellenformen entwickelt wurde, zeigte keine Überlegenheit gegenüber dem MLM, das mit nicht ausgewählten Wellenformen entwickelt wurde (ergänzende Abbildung 6a). Im Gegensatz dazu führte MLM-3, das unter Verwendung von 703 zusammengesetzten Bildern mit der ausgewählten Wellenform für schwache Signale entwickelt wurde, zu besseren durchschnittlichen Präzisionen als der Fall von MLM-1, das unter Verwendung zusammengesetzter Bilder unter Verwendung nicht ausgewählter Wellenformen entwickelt wurde (ergänzende Abbildung 6b). Um unsere neue ML-Methode weiter zu charakterisieren, führten wir MLs mit der gleichen Anzahl von Wellenformen sowohl in einzelnen als auch in zusammengesetzten Wellenformbildern durch. Wir haben ähnliche durchschnittliche Genauigkeiten von 0,829 bzw. 0,809 erhalten (ergänzende Abbildung 7).

Die Auswirkungen der neuen Methodik des maschinellen Lernens (ML). (a) MLs wurden unter Verwendung eines Einzelwellenformbildes für das Training durchgeführt. (b) MLs wurden mit zusammengesetzten Bildern (neun Wellenformen in einem Bild) zu Bildungszwecken durchgeführt. (c) Vorhersage, dass Haloperidol als neue Substanz zur Gruppe der positiven neuronalen Aktivität gehört.

Dieser Bericht bestätigte die Aktivität der Kalziumsignaltransduktion über P2X7, die in menschlichen iNSCs exprimiert wird. Die physiologische Bedeutung von P2X7 in NSCs in vivo ist derzeit nicht ausreichend charakterisiert; Unsere Beobachtungen zeigen jedoch, dass mit ATP behandelte iNSCs ein beschleunigtes Wachstum zeigten und die Behandlung mit Brilliant Blue G dieses Wachstum beeinträchtigte (Daten nicht gezeigt), ähnlich wie es bei Tumorzellen berichtet wurde. Insgesamt können NSCs ihr Wachstum steuern, indem sie pathologische Zustände erkennen28. Im Gegensatz dazu unterliegen reife Neuronen der Apoptose, wenn P2X7 stimuliert wird29. Diese gegensätzlichen Reaktionen in NSCs, Tumorzellen und reifen Neuronen könnten hypothetisch durch die evolutionär erhaltene Fähigkeit zellbasierter Reparaturmechanismen wie der Gehirnregeneration erklärt werden, die bei niederen Tieren beobachtet wird30. Wir fanden heraus, dass die Mehrheit der iNSCs über P2X7 auf extrazelluläres ATP reagiert. Zusätzlich zur P2X7-Expression haben wir vorgeschlagen, dass iNSCs auch P2Y-Rezeptoren über die Beobachtung intrazellulärer Calciumwellen exprimieren, wenn die P2X7-vermittelten Calciumfunken durch den P2X7-spezifischen Antagonisten Brilliant Blue G blockiert wurden21,22,23,24.

iNSCs sind keine homogenen Populationen. Die Behandlung mit Adenosintriphosphat (ATP) führt zu gemischten Reaktionen aus zufälligen Kalziumfunken und Wellen mit unterschiedlichen Dynamikbereichen. Frühere Studien haben die ML-Methode angewendet, um Wellenformen als digitalisierte Bilder31 oder als eindimensionale Zeitreihendaten32 zu analysieren. Wir stellten die Hypothese auf, dass ML mithilfe von Rohwellenformbildern für die Verarbeitung der vielfältigen Wellenformdaten von Kalziumfunken effektiver sein könnte. Allerdings zeigte der erste ML-Versuch, bei dem einzelne Wellenformen verwendet wurden, unbefriedigende Ergebnisse. Wir stellten die Hypothese auf, dass der mögliche Grund für dieses Scheitern darin liegt, dass ML durch die großen Abweichungen der Signaldynamikbereiche von Wellenformdaten stark beeinträchtigt werden könnte, und beschlossen, ML mit zusammengesetzten Bildern mit neun Wellenformen in einem auszuprobieren, um die Wirkung solcher Bilder abzuschwächen. Beim Vergleich der beiden oben genannten ML-Methoden haben wir festgestellt, dass die letztere Methode eine weitaus bessere Vorhersagegenauigkeit erreichen kann, was darauf hindeutet, dass unsere neue ML-Strategie bei der Verwendung von Signalen mit stark variabler Wellenform einen Vorteil haben könnte.

ML wurde erfolgreich auf bildgebende Bereiche, auch im medizinischen Bereich, angewendet, um die Diagnose durch die Erkennung von Krebsgewebe in Bilddaten und die Unterscheidung subtiler Veränderungen zu unterstützen. Bei den meisten Anwendungen im visuellen Bereich können Menschen die Vorhersagen des MLM bestätigen. Im Gegensatz dazu können in iNSCs entdeckte Kalziumfunken vom Menschen nicht anhand klassischer Parameter wie Frequenz oder Dynamikbereich klassifiziert werden, was darauf hindeutet, dass unser MLM nicht identifizierte Merkmale der Wellenformen erkennen kann. Um diesen Mechanismus zu untersuchen, führten wir ML nur mit den ausgewählten schwachen Signalwellenformen durch. Wir fanden heraus, dass nur das MLM, das mit zusammengesetzten schwachen Signalwellenformen entwickelt wurde, zu unerwartet besseren durchschnittlichen Präzisionen führte als das Modell, das mit zusammengesetzten Bildern einschließlich zufällig ausgewählter Wellenformen entwickelt wurde. Dies könnte daran liegen, dass ML sich auf wesentliche Unterschiede konzentrieren kann, wenn die Dynamikbereichsabweichungen in den Lerndaten reduziert werden. Bitte beachten Sie, dass selbst die Verwendung ausgewählter Bild-MLMs, die mit einzelnen Wellenformen entwickelt wurden, eine schlechtere Vorhersagefähigkeit zeigten, was die robuste Überlegenheit unserer „Wellenform-Composite-Methode“ unterstreicht. Schließlich haben wir bestätigt, dass ähnliche Vorhersagefähigkeiten von MLMs erhalten wurden, wenn die gleiche Anzahl von Wellenformen für MLs verwendet wurde, was darauf hindeutet, dass der Grund, warum unsere neue ML-Methode sinnvolle Unterschiede in Wellenformen extrahieren kann, in der Verstärkung durch effektives wiederholtes Lernen unter Verwendung der Wiederverwendung von Wellenformen liegen könnte. Im Gegensatz zu den oben genannten Vorzügen haben wir festgestellt, dass die Vorhersagegenauigkeit der „Wellenform-Composite-Methode“ von der Zellcharge abhängt, was bedeutet, dass Lernwellenformen und Testsubstanz-behandelte Wellenformen mit denselben iNSCs erhalten werden sollten. Denn selbst wenn wir die iNSCs, die aus denselben Master-Frozen-Beständen stammten, zweimal verwendeten, war das entwickelte MLM unter Verwendung eines kultivierten iNSC für die Vorhersage der verschiedenen, aus Zellchargen stammenden Wellenformen nicht effektiv. Dies könnte daran liegen, dass die subtilen Unterschiede in den iNSCs ML beeinflussen könnten. Um die Chargenunterschiede bei iNSCs zu minimieren, könnte die Verwendung einer automatisierten Kulturmaschine eine Lösung sein33. Darüber hinaus gelang es unserer ML-Methode teilweise, nicht-informierte Substanzen korrekt zu trennen, was darauf hindeutet, dass ML mit größeren Wellenformdatensätzen für eine bessere Vorhersagbarkeit für nicht-informierte Substanzen erforderlich wäre.

In einem ähnlichen Beispiel weist ML im Vergleich zu Menschen eine bessere Datenunterscheidung auf. Beispielsweise waren ML-Modelle in der Lage, ventrikuläre Extrasystolen während des Sinusrhythmus und nicht während einer Arrhythmie zu erkennen, und es ist selbst für gut ausgebildete Ärzte schwierig, ventrikuläre Extrasystolen während normaler Rhythmen vorherzusagen32. Die Autoren diskutierten einen möglichen Mechanismus, durch den MLM subtile EKG-Strukturveränderungen erkennen kann, die ventrikuläre vorzeitige Komplexe hervorheben. In der obigen Studie haben Chang et al. führte ML durch, indem eindimensionale Zeitreihendaten aus zweidimensionalen Bildern konvertiert wurden. Unseres Wissens nach ist unsere Studie die erste, die über die Entwicklung eines hochpräzisen MLM zur Analyse subtiler, nicht identifizierter Veränderungen berichtet, die mit Rohwellenformbildern mit einem hohen Grad an Variabilität entwickelt wurden.

Wir haben bestätigt, dass die Vorbehandlung einen charakteristischen Effekt auf das globale mRNA-Expressionsprofil hatte. Allerdings war die betroffene Genexpression mit Ausnahme von Valproinsäure sehr gering. Überraschenderweise kann unser MLM die zellulären Kalziumreaktionsmerkmale anhand einiger solcher genetischer Veränderungen unterscheiden. Daher haben wir die auf der Gene Ontologie (GO) basierende Kategorisierung der Genexpressionsänderungen sorgfältig überprüft und festgestellt, dass alle positiven Gruppenmitglieder gemeinsame Genexpressionsänderungen im Zusammenhang mit „passiver Transmembrantransportaktivität“ und „Kanalaktivität“ aufwiesen, was darauf hindeutet, dass solche Änderungen in Transmembranaktivitäten könnten die mechanistischen Grundlagen der dosisabhängigen neuronalen Wirkungen der getesteten Verbindung sein, die von unserem MLM nachgewiesen werden können. Das obige Ergebnis unterstreicht auch, dass das mit unserer neuen ML-Methode entwickelte MLM ein leistungsstarkes Werkzeug sein kann, um die verborgenen internen Veränderungen von iNSCs durch neuronal wirksame Substanzen aufzudecken.

Die vom Menschen induzierte pluripotente Stammzelllinie 253G1 wurde vom Labor für pluripotente Zellstudien, RIKEN BioResource Research Center, Tsukuba City, Ibaragi, Japan, bezogen.

Die hiPSCs wurden in 10-cm-Kunststoffplatten (Corning Inc., NY, USA) gehalten, die mit 0,5 μg/cm2 iMatrix511 Silk (Nippi Inc., Tokio, Japan) mit StemFit® AK02N (Ajinomoto, Tokio, Japan) als Kulturmedium beschichtet waren unter kontrollierter Atmosphäre bei 37 °C, 5 % CO2 und > 95 % Luftfeuchtigkeit. Die Zellen, die eine Konfluenz von 70–90 % erreichten, wurden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Kalzium (PBS(-); Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan) gewaschen und mit 3 ml TripLE™ Express-Enzym (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ergänzt mit 10 μM des Rho-Kinase-Inhibitors Y-27632 (Sellec Inc., Tokio, Japan) für 15 Minuten bei 37 °C. Die Ablösung und Dispergierung in einzelne Zellen erfolgte durch Pipettieren mit 10-ml-Pipetten unter Zugabe von 5 ml PBS(-), ergänzt mit 0,15 % Rinderserumalbumin, Fraktion V (BSA: Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan). Die Zellen wurden in einem 15-ml-Röhrchen gesammelt und zur Abscheidung 5 Minuten lang bei 800 U/min (115 × g) zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgesaugt und das Zellpellet mit 10 ml Stemfit, ergänzt mit 10 μM Y-27632, durch Pipettieren in einzelne Zellen dispergiert.

Um die Differenzierung einzuleiten (Tag 1), wurden undifferenzierte iPSCs mit einer Dichte von 25.000 Zellen/cm2 in einer mit 1/100 verdünntem Matrigel® (Corning Inc.) beschichteten 10-cm-Schale mit 10 ml neuroektodermalem induzierendem Medium, bestehend aus modifiziertem Dulbecco, ausgesät Eagle-Medium (DMEM)/F12 (Fuji Film Wako Chemical Inc.) und Neurobasal-Medium (1:1; Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren, 1 mM GlutaMAX® (Thermo Fisher Scientific) mit 10 μM TGF-beta Rezeptorinhibitor (SB431542), 10 μM BMP-Signalinhibitor (LDN-193189) und 10 μM Y-27632. Medienwechsel wurden am 3. Tag durchgeführt. Am Differenzierungstag 5 wurde das Medium auf Neuroektodermal-induzierendes Medium, ergänzt mit 10 % Knockout-Serumersatz (Thermo Fisher Scientific), 50 μg/ml Ascorbinsäure-2-phosphat (Merck), umgestellt. und 10 ng/ml bFGF (Nacalai Tesque Inc.). Medienwechsel wurden an den Tagen 7 und 8 durchgeführt. Am Differenzierungstag 9 wurden die Zellen passagiert, um sie in drei 10-cm-Schalen mit 10 ml iNSC-Expansionsmedium, bestehend aus DMEM/F12 und neurobasalem Medium 1:1, ergänzt mit 0,1 mM nicht-essentieller Substanz, aufzuteilen Aminosäuren, 1 mM GlutaMAX®, 1 % N-2-Ergänzung (Thermo Fisher Scientific), 1 % B-27-Ergänzung (Thermo Fisher Scientific), 10 % Knockout-Serumersatz und 50 ng/ml bFGF. Die Medien wurden täglich gewechselt. Die Zellen, die 100 % Konfluenz erreichten, wurden zur Expansion erneut passagiert. Die resultierenden Zellen wurden mit CELLBANKER-1 (Zenogen Pharma Co., Ltd., Fukushima, Japan) kryokonserviert.

Die kryokonservierten iNSCs wurden aufgelöst und in Matrigel®-beschichteten 10-cm-Schalen mit 10 ml des iNSC-Expansionsmediums ausgesät und in einem Inkubator bis zur Konfluenz kultiviert. Nach einmaligem Waschen mit 10 ml PBS(-) wurden die Zellen abgelöst und unter Verwendung von 4 ml TrypLE Express drei Minuten lang bei 37 °C dissoziiert. Die Zellen wurden zu einem Pellet zentrifugiert und anschließend mit iNSC-Expansionsmedium ohne bFGF und mehreren Pipettierschritten dissoziiert. Die 1/20-Fraktion der geernteten Zellen wurde in eine Matrigel-beschichtete Glasbodenschale (Cell Imaging Dish 170 μm, 35 mm, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) ausgesät. Am nächsten Tag wurde das Medium durch 500 μl iNSC-Expansionsmedium ohne bFGF mit den in Tabelle 1 aufgeführten Testsubstanzen ersetzt. Anschließend wurden die Zellen 12–16 Stunden lang in einem Inkubator behandelt. Anschließend wurde das Medium durch 500 μl vorgewärmtes iNSC-Expansionsmedium ohne bFGF mit Fluo4-AM (Biotium Inc., Fremont, CA, USA) ersetzt und zur Farbstoffbeladung 30 Minuten bei 37 ° C inkubiert. Die Zellen wurden mit 500 μl vorgewärmtem iNSC-Expansionsmedium ohne bFGF gewaschen und dann wurde das Medium durch 500 μl vorgewärmtes iNSC-Expansionsmedium ohne bFGF mit 20 μM ATP (Nacalai Tesque Inc.) ausgetauscht. Nach der ATP-Behandlung nahm die Zellfluoreszenz schnell zu und nahm innerhalb von etwa 200 s allmählich ab (ergänzende Abbildung 8). Daher wurde mit der Aufzeichnung der Calciumfunken 200 s nach der ATP-Zugabe begonnen. Danach haben wir nacheinander 5 Minuten lang in mindestens drei zufällig ausgewählten Sichtfeldern aufgezeichnet. Zeitrafferbilder (512 × 512 Pixel) wurden alle 1 s mit einer Belichtungszeit von 100 ms aufgenommen (Eclipse Ti2, Nikon Instruments, Tokio, Japan). Die erhaltenen Bilder wurden mit der NIS Elements-Software (Nikon Instruments) als Video im Audio-Video-Interleave-Format (AVI) exportiert. Um die Wirkung der P2X7-Hemmung auf ATP-induzierte Calciumfunken zu untersuchen, wurden dem Medium vor der ATP-Exposition 20 μM BBG, 20 μM JNJ-47965567 oder 10 μM AZD9056 zugesetzt.

Die aufgenommenen Kalziumbildgebungsvideos wurden kontrastverstärkt, mit der ImageJ-Software geglättet und in Graustufen-Multitiff-Dateien konvertiert. Für die konvertierten Daten wurde die von Romano et al. veröffentlichte MATLAB-Toolbox verwendet. wurde verwendet, um Änderungen der Fluoreszenzintensität zu verfolgen und sie in Wellenformdaten umzuwandeln34. Regionen von Interesse (ROIs) wurden mithilfe einer hexagonalen Segmentierung mit einem Durchmesser von 20 μm festgelegt. Die Grundskala des Fluoreszenzrauschens wurde durch Einpassen in ein Gaußsches Modell geschätzt. Spikehaltige ROIs wurden mithilfe des Toolbox-Parameters „Smooth Slow Dynamic“-Schwellenwertmodus ausgewählt. Wellenformdaten wurden im Format der Joint Photographic Experts Group erstellt. Für ML wurden Wellenformdaten verwendet, entweder eine Wellenform als ein Datenpunkt oder ein Datenpunkt mit einer Kombination aus neun zufällig ausgewählten Wellenformbildern. MLs wurden mit AutoML Vision auf der Google Could Platform (https://cloud.google.com/automl) durchgeführt. AutoML Vision teilt 90 % der Gesamtsumme nach dem Zufallsprinzip für Training und Validierung und 10 % für Tests auf. Das Testen der gruppeninternen Daten und der neuen Daten des ML-Modells (MLM) wurde durch Eingabe jeder Wellenform in das MLM durchgeführt.

iNSCs wurden mit keinem behandelt, mit niedrig dosiertem Koffein als negative Gruppe und mit hochdosiertem Koffein, Valproinsäure und Haloperidol als positive Gruppe, wie im Abschnitt zur Kalziumbildgebung beschrieben. Die Gesamt-RNA wurde mit Isogen extrahiert und mit RNase-freier DNase (QIAGEN, Venlo, Niederlande) behandelt. Der Aufbau und die Sequenzierung der Bibliothek wurden von Novogene Co. Ltd. (Peking, China) durchgeführt. Kurz gesagt, die angereicherte mRNA wurde zufällig fragmentiert, gefolgt von der cDNA-Synthese unter Verwendung einer mRNA-Matrize und zufälligen Hexamer-Primern. Nach der Zweitstrangsynthese wurde die Sequenzierungsadapterligation durchgeführt. Mittels Größenselektion und PCR-Anreicherung wurden fertige doppelsträngige cDNA-Bibliotheken entwickelt. RNA-Bibliotheken wurden auf einem HiSeq-Sequenzer (Illumina) sequenziert. Bioinformatische Analysen wurden von Novogene Co., Ltd. durchgeführt.

Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 25 °C in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Danach wurden die Zellen zweimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,2 % Tween-20 (TBS-T) enthielt, gewaschen und 30 Minuten lang bei 25 °C mit einer Blockierungslösung (Nacalai Tesque) behandelt. Das den primären Antikörper enthaltende Blockierungsmittel wurde den Zellen zugesetzt und über Nacht bei 4 °C unter Paraffinversiegelung inkubiert, um eine Verdunstung zu verhindern. Die Zellen wurden dreimal mit TBS-T gewaschen und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in das sekundäre Antikörper enthaltende Blockierungsmittel eingetaucht. Nach drei Wäschen wurden die Fluoreszenzsignale mit einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon Instruments, Tokio, Japan) beobachtet. Die verwendeten primären und sekundären Antikörper sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

NSCs wurden einmal mit PBS(-) gewaschen und unter Verwendung von RIPA-Puffer (Nacalai Tesque Inc.) mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail (#08714, Nacalai Tesque Inc.) lysiert. Wir führten eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit 4–12 % Bolt™ Bis-Tris und einem 1,0 mm Mini-Protein-Gel-System durch. Die Proteine ​​wurden auf eine Polyvinylidenfluoridmembran (#1214726, GVS, SpA Rom, Italien) übertragen und mittels Western Blot analysiert. Die verwendeten primären und sekundären Antikörper sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Das Lumineszenzsignal wurde mit einem Meerrettich-Peroxidase-Substrat (Amersham™ ECL™ Prime, Cytiva, Tokio, Japan) erhalten und mit Fusion Solo-S (Vilber, Collégien, Frankreich) erfasst. . Als interne Kontrolle haben wir Beta-Actin-Protein mithilfe derselben Membran nachgewiesen, die nach Behandlung mit Stripping-Lösung (Fuji Film Wako Chemical Inc.) erneut untersucht wurde.

Die Gesamt-RNA wurde mit ISOGEN (Nippon Gene, Tokio, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers aus den Zellen extrahiert. Die reverse Transkription von 500 ng Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines Versa-cDNA-Synthesekits (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Die quantitative Polymerasekettenreaktion wurde unter Verwendung von Thunderbird® Next SYBR® qPCR Mix (Toyobo, Co. Ltd., Osaka, Japan) mit genspezifischen Primersätzen für Nestin und p2 × 7-mRNA durchgeführt. Alle Experimente wurden mit drei unabhängigen Proben durchgeführt. Alle Genexpressionsniveaus wurden auf die Expressionsniveaus der internen ribosomalen Protein-S18-RNA normalisiert. Die Primerpaarsequenzen sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt.

Statistische Analysen wurden durch einen ungepaarten Student-t-Test unter Verwendung der Microsoft Excel-Software durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde auf P < 0,05 festgelegt.

Rohe mRNA-Sequenzierungsdaten sind in der DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Bio Project Accession Number: PRJDB15077) verfügbar. Die anderen in dieser Studie vorgestellten Originalbeiträge sind im Artikel und in den ergänzenden Materialien enthalten, und weitere Anfragen können an den entsprechenden Autor gerichtet werden.

Chen, YC, Guo, YL, Hsu, CC & Rogan, WJ Kognitive Entwicklung von Yu-Cheng-Kindern („Ölkrankheit“), die vor der Geburt hitzeabbaubaren PCBs ausgesetzt waren. JAMA 268, 3213–3218 (1992).

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Wir möchten Dr. Ray Yueh Ku und Dr. Kazue Hashimoto-Torii vom Children's National Medical Center, Washington, DC, USA, für ihre technische Unterstützung danken. Die persönliche Kommunikation mit Dr. Kazue Hashimoto-Torii führte zu einem wesentlichen Teil der Grundkonzepte dieser Studie.

Suntory Holdings Co., Ltd. stellte ein kooperatives Forschungsstipendium bereit.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yuki Hanafusa und Fumiyuki Hattori.

Innovative Regenerative Medizin, Graduate School of Medicine, Kansai Medical University, Osaka, Japan

Yuki Hanafusa und Fumiyuki Hattori

Group Quality Assurance Division, Safety Science Institute, Suntory Holdings Ltd., Tokio, Japan

Yuki Hanafusa

Abteilung für integrative biomolekulare Funktionen, Bioorganic Research Institute, Suntory Foundation for Life Sciences, Kyoto, Japan

Akira Shiraishi

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YH und FH trugen gleichermaßen zur Studie bei. YH und FH entwickelten das Konzept und Design der Studie. FH führte Laborarbeiten durch, um die Daten zu erhalten. YH und AS führten Datenverarbeitung und maschinelles Lernen durch. YH und FH haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Fumiyuki Hattori.

YH, AS, FH erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen. YH ist ein Mitarbeiter von Suntory Holdings Co., Ltd. Diese Studie wurde von Suntory Holdings Co., Ltd. finanziert. Der Geldgeber war nicht am Studiendesign, der Sammlung, Analyse, Interpretation von Daten, dem Verfassen dieses Artikels oder der Entscheidung beteiligt es zur Veröffentlichung einzureichen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hanafusa, Y., Shiraishi, A. & Hattori, F. Maschinelles Lernen unterscheidet P2X7-vermittelte intrazelluläre Kalziumfunken in vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen, die aus neuralen Stammzellen stammen. Sci Rep 13, 12673 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39846-4

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Eingegangen: 31. Januar 2023

Angenommen: 31. Juli 2023

Veröffentlicht: 04. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39846-4

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