Maschinelles Lernen und Metagenomik offenbaren gemeinsame antimikrobielle Resistenzprofile in mehreren Hühnerfarmen und Schlachthöfen in China

Nature Food Band 4, Seiten 707–720 (2023)Diesen Artikel zitieren

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China ist der weltweit größte Verbraucher antimikrobieller Mittel und verbesserte Überwachungsmethoden könnten dazu beitragen, die Ausbreitung antimikrobieller Resistenzen (AMR) zu verringern. Hier berichten wir über die Überwachung von zehn großen Hühnerfarmen und vier angeschlossenen Schlachthöfen in drei chinesischen Provinzen über einen Zeitraum von 2,5 Jahren. Mithilfe eines auf maschinellem Lernen basierenden Data-Mining-Ansatzes analysierten wir 461 Mikrobiome von Vögeln, Kadavern und Umgebungen und identifizierten 145 potenziell mobile Antibiotikaresistenzgene (ARGs), die von Hühnern und Umgebungen in allen Betrieben gemeinsam genutzt werden. Ein Kernsatz von 233 ARGs und 186 Mikrobenarten, die aus dem Mikrobiom des Hühnerdarms extrahiert wurden, korrelierte mit den AMR-Profilen von Escherichia coli, die denselben Darm besiedeln, einschließlich Arcobacter, Acinetobacter und Sphingobacterium, die für den Menschen klinisch relevant sind, sowie 38 klinisch relevanten ARGs. Auch Temperatur und Luftfeuchtigkeit in den Ställen korrelierten mit dem Vorkommen von ARG. Wir enthüllen ein komplexes Netzwerk von Korrelationen zwischen Umgebungen, mikrobiellen Gemeinschaften und AMR und schlagen mehrere Wege zur Verbesserung der AMR-Überwachung in der Tierproduktion vor.

Der Einsatz antimikrobieller Mittel in der Geflügelproduktion in China ist fünfmal höher als im internationalen Durchschnitt1. Der Einsatz von Antibiotika verändert und erweitert das Darmresistom bei Nutztieren, selbst in geringen Mengen2, und die mikrobielle Gemeinschaft kann Phänotypen der antimikrobiellen Resistenz (AMR) prägen3. Äußere Ereignisse wie Ernährungs-, Temperatur- und Stressänderungen4,5 können zur Kolonisierung neuer ansässiger Arten oder zur Übertragung von AMR zwischen Arten führen6. Temperatur, Luftfeuchtigkeit und sowohl die Häufigkeit von Bakterienarten als auch das Vorhandensein von Antibiotikaresistenzgenen (ARGs)7,8,9 können bakterielle Infektionen bei Broilern beeinflussen10. Zusammenhänge zwischen Umweltbedingungen und AMR sind besonders relevant für China und Länder mit niedrigem und mittlerem Einkommen (LMICs), wo die Aufrechterhaltung stabiler Umweltbedingungen in der industriellen Landwirtschaft im Vergleich zu Ländern mit hohem Einkommen eine Herausforderung sein kann11.

Die AMR-Überwachung in Bereichen außerhalb des Gesundheitswesens ist noch nicht weit verbreitet12, ist jedoch von entscheidender Bedeutung für das Verständnis, wie Lebensmittelproduktionssysteme zur Auswahl und Verbreitung antibiotikaresistenter Bakterien (ARB) und ARGs beitragen. Maschinelles Lernen (ML) und Big Data Mining bieten Werkzeuge zur Förderung der Präzisionsgeflügelhaltung13,14. Kulturbasierte Ansätze, die die Sequenzierung des gesamten Genoms (WGS) einzelner Krankheitserreger, Antibiotika-Empfindlichkeitstests und ML-Techniken umfassen, sind wirksame Prädiktoren für genomische Merkmale im Zusammenhang mit AMR sowohl für Escherichia coli-Isolate15,16,17,18 als auch für andere Bakterien19,20,21,22 ,23,24. Überwachungsansätze, die sich ausschließlich auf die WGS einzelner Krankheitserreger konzentrieren, erfassen jedoch möglicherweise nicht die Vielfalt der mikrobiellen Gemeinschaften und Resistome in der Tierproduktion, und ARG-Daten werden möglicherweise übersehen25. In einer kürzlich durchgeführten Proof-of-Concept-Studie haben wir beobachtet, dass mehrere im Fäkalienresistom von Hühnern vorhandene ARGs mit den Resistenz-/Anfälligkeitsprofilen von E. coli-Isolaten korrelieren, die aus denselben Proben kultiviert wurden26.

In dieser Studie haben wir eine Referenzmethode für die metagenomische Überwachung entwickelt, die auf die chinesische Viehhaltung abzielt, wo die AMR-Überwachung eine besondere Herausforderung darstellt. Dabei verwendeten wir einen Ansatz, der den Mangel an Laborressourcen berücksichtigt, der in China und LMICs häufig herrscht27,28. Wir verwendeten E. coli als Indikatorspezies für AMR im weiteren Kontext der mikrobiellen Gemeinschaft, die den Hühnerdarm bevölkert. Um breitere Kontexte zu berücksichtigen, untersuchten wir die Auswirkungen auf die Mikrobiome der umliegenden und angeschlossenen landwirtschaftlichen Umgebungen sowie auf die Temperatur und Luftfeuchtigkeit im Stall und führten Protokolle für die Verabreichung antimikrobieller Mittel ein.

Biologische Proben wurden in zehn großen kommerziellen Geflügelfarmen gesammelt (siehe Methoden, ergänzende Informationen, ergänzende Abbildung 1 und ergänzende Tabellen 1 und 2). Mikrobielle Gemeinschaften und ARGs wurden zwischen landwirtschaftlichen Quellen sowie zwischen landwirtschaftlichen Betrieben und Schlachthöfen unterschieden (Ergänzende Informationen, ergänzende Abbildungen 2–5 und ergänzende Tabellen 3–5). Da die Genmobilität das Vorhandensein von ARG in verschiedenen Quellen beeinflussen kann und mobile genetische Elemente (MGEs) möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Entwicklung wirksamer Überwachungssysteme spielen29, suchten wir nach ARGs, die sich innerhalb von 5 Kilobasen (kb) von einem MGE26 befanden, und berücksichtigten diese MGE– ARG-Kombinationen gelten als potenziell mobile ARGs. Insgesamt wurden 661 verschiedene MGE-ARG-Kombinationen (potenziell mobile ARGs) mit 195 einzigartigen ARGs gefunden (Ergänzungstabelle 6). Davon wurden 75 ARGs (38 %) nur in einer MGE-ARG-Kombination gefunden, während die restlichen 120 (62 %) in mehreren Kombinationen (2 bis 22; Abb. 1a) gefunden wurden. Über die Hälfte (56 %) der 661 potenziell mobilen ARGs waren in mehr als einer Quelle vorhanden (Abb. 1b), mit drei MGE-ARG-Kombinationen (IS1216-poxtA, IS15-APH(3′)-Ia und ISCfr1-AAC( 3)-IId) in allen Quellen außer Federn vorhanden. Hühnerkot hatte die höchste Anzahl potenziell mobiler ARGs, aber auch die größte Varianz (Abb. 1c). Federn und Scheunenboden trugen auch viele potenziell mobile ARGs, deren mittlere Anzahl statistisch dem Kot entsprach (Dunn-Test angepasst P > 0,05). Boden im Freien, Kadaver, Verarbeitungslinie und Abwasser wiesen im Allgemeinen eine geringere Anzahl potenziell mobiler ARG-Muster pro Probe auf, wobei sich diese Zahlen deutlich von Kot und Federn unterschieden (Dunn-Test angepasst P < 0,01), nicht jedoch voneinander. Insgesamt wurden in allen 10 Betrieben 145 verschiedene MGE-ARG-Kombinationen in Vogel- und Umweltquellen auf demselben Betrieb gefunden, wobei einige davon auf mehreren Betrieben auftraten. Davon enthielten 46 klinisch relevante ARGs30 (Abb. 1d). Insbesondere fanden wir blaNDM-5 in Hühnerkot, Federn und Bodenproben aus der Umwelt. Dieses Gen kommt häufig auf dem IncX3-Plasmid vor, das zwischen Menschen, Tieren, Nahrungsmitteln und der Umwelt verbreitet werden kann31, obwohl wir das Vorhandensein von Plasmiden in unseren Short-Read-Metagenom-Sequenzierungsdaten (MGS) nicht bestätigt haben. Ein weiteres wichtiges klinisch relevantes Gen, qnrS1, wurde in Hühnerkot, Federn, Stallböden und Abwasserproben gefunden. Es ist bekannt, dass dieses plasmidvermittelte Chinolon-Resistenzgen in der Lieferkette von Hühnern vorhanden ist und auf verschiedene Bakterien übertragen werden kann32.

a, Kreisdiagramm, das den Anteil der ARGs (von den 195 gefundenen) zeigt, die mit einem oder mehreren MGEs verbunden sind. b: Ungerichtetes Netzwerkdiagramm, das potenziell mobile ARGs (kleine orangefarbene Kreise) zeigt, die mit verschiedenen Probenquellen (große grüne Kreise) verknüpft sind. Die Kanten im Diagramm verknüpfen die potenziell mobilen ARGs mit den Quellen, in denen sie gefunden wurden. c, Anzahl potenziell mobiler ARGs pro Probe und Quelle. Jeder Kreis stellt eine einzelne Probe dar, wobei die Kreise nach Betrieb gefärbt sind. d, Venn-Diagramm, das zeigt, dass 145 (von 661) potenziell mobilen ARGs sowohl in Hühner- als auch in Umweltproben aus demselben Betrieb vorhanden waren und 182 potenziell mobile ARGs klinisch relevante ARGs enthielten. Es wurde eine Überlappung von 46 klinisch relevanten30 potenziell mobilen ARGs in Hühnern und Umweltquellen aus demselben Betrieb gefunden. Beachten Sie, dass in dieser Analyse Proben aus derselben Quelle, die zu t1 (Woche 3) und t2 (Woche 6) gesammelt wurden, zusammengefasst wurden, was dazu führte, dass für jeden Betrieb insgesamt sieben Quellen berücksichtigt wurden.

Wir untersuchten weiter, ob eine Korrelation zwischen den im Hühnerdarm gefundenen Bakterienarten, dem Resistom (d. h. den ARGs aller Arten) und den AMR-Profilen von E. coli-Isolaten besteht, die aus denselben Proben wie die Metagenomdaten entnommen wurden. Wir haben E. coli-Isolate aus 170 Hühnerkotproben (eine Teilmenge der Proben, die für die Metagenomik verwendet wurden) kultiviert und ihre AMR-Profile gegenüber einer Gruppe von 26 Antibiotika charakterisiert. Der Anteil der gegen jedes Antibiotikum resistenten Isolate lag zwischen 1 % und 98 % (Ergänzungstabelle 7). Alle Isolate waren gegen mindestens ein Antibiotikum resistent, 169 davon gegen mindestens drei.

Um die Zusammenhänge zwischen Antibiotikaresistenz in E. coli und dem Darmmikrobiom zu untersuchen, haben wir eine maßgeschneiderte Data-Mining-Methode auf Basis von ML entwickelt (Abb. 2). Die Methode besteht aus dem Aufbau einer ML-gestützten „Vorhersagefunktion“, deren Eingabe die Aggregation von Informationen aus der Darmmikrobengemeinschaft (relative Häufigkeit mikrobieller Arten) und dem Darmresistom (ARG-Anzahl) ist und deren Ausgabe die Resistenz von E. coli gegen ist ein bestimmtes Antibiotikum (richtig oder falsch) aus dem Antibiotika-Empfindlichkeitstest (AST). Die Vorhersagefunktion wurde trainiert, indem experimentelle Daten verwendet wurden (überwachtes Lernen) und verschiedene zugrunde liegende ML-Technologien ausgetauscht wurden, bis eine optimale Vorhersageleistung erreicht wurde. Aus den ML-Modellen wurde eine Reihe der informativsten Merkmale extrahiert, die auch als „Prädiktoren“ bezeichnet werden. Der Satz wurde dann durch Analyse der Korrelation mit Temperatur und Luftfeuchtigkeit verfeinert (siehe später).

Der vollständige Datenanalyse-Workflow der maßgeschneiderten Data-Mining-Methode basierend auf ML. Eingabedaten werden grün angezeigt. Phase I umfasst die Vorverarbeitung von Metagenomdaten (in gelb). Die Schritte werden im Abschnitt „Methoden“ ausführlich beschrieben. Phase II umfasst das Training und Testen von ML-gestützten Vorhersagefunktionen, um metagenomische Merkmale (d. h. die ARG-Anzahl und die relative Häufigkeit der in der Probe vorhandenen mikrobiellen Arten) zu isolieren, die mit der phänotypischen Resistenz (in Blau) korrelieren. Phase III beinhaltet die Anpassung von Regressionsmodellen (wird im nächsten Abschnitt besprochen), um metagenomische Merkmale zu isolieren, die besser mit Schwankungen von Temperatur und Luftfeuchtigkeit (in Rot) korrelieren. AUC, Fläche unter der Kurve.

Von den 26 Antibiotika lagen nur für 17 ausreichende Daten (Resistenz- und Anfälligkeitsfälle) vor, um ein ordnungsgemäßes ML-Training zu ermöglichen: Amikacin, Amoxicillin-Clavulansäure, Aztreonam, Cefepim, Cefoxitin, Cefotaxim-Clavulansäure, Ceftazidim, Ceftazidim-Clavulansäure, Chloramphenicol, Cefotaxim, Gentamycin, Kanamycin, Minocyclin, Nalidixinsäure, Streptomycin, Sulfafurazol und Trimethoprim-Sulfamethoxazol. Insgesamt wurde die beste Vorhersageleistung (Nemenyi-Test) mit dem zusätzlichen Baumklassifikator (ML-Technologie; Ergänzungstabelle 8 und Ergänzungsabbildung 6) beobachtet. Die mit der Extra-Tree-Methode berechneten Vorhersageleistungsindikatoren sind in Abb. 3a und der ergänzenden Abb. 7 dargestellt. Zehn Vorhersagemodelle (Amikacin, Aztreonam, Cefoxitin, Chloramphenicol, Cefotaxim, Kanamycin, Nalidixinsäure, Streptomycin, Sulfafurazol und Trimethoprim-Sulfamethoxazol) wurden erreicht Leistungen über AUC > 0,90.

a, Leistung der ML-gestützten Vorhersagefunktionen der E. coli-Resistenz gegen bestimmte Antibiotika (ML-Technologie: zusätzlicher Baumklassifikator; siehe Methoden). Leistungsindikatoren (AUC, Genauigkeit und Präzision) wurden als Durchschnitt von 30 Iterationen einer verschachtelten Kreuzvalidierung berechnet (siehe Methoden). Siehe ergänzende Abbildung 2 für die Sensitivität, Spezifität und den Cohen-Kappa-Score der Leistungsindikatoren. Die Violindiagramme zeigen die Verteilung der Daten, wobei jeder Datenpunkt ein Antibiotikamodell darstellt. In jedem Geigendiagramm befindet sich ein Boxplot, wobei die Box den Interquartilbereich (IQR) zeigt, die Whiskers den Rest der Verteilung als Anteil von 1,5 x IQR zeigen und der weiße Kreis den Medianwert darstellt. b, Anzahl der metagenomischen Merkmale (ARGs und mikrobielle Spezies), die sich als stärkste Prädiktoren für E. coli-Resistenz-/Empfindlichkeitsprofile für jedes Antibiotikum erwiesen haben. c, Ungerichtetes Diagramm, das die stärksten Prädiktoren (Metagenommerkmale im Hühnerdarm) für jedes Antibiotikamodell zeigt. Die Kanten des Diagramms verknüpfen ARG- oder Bakterienartenknoten (Prädiktorvariablen) mit dem Antibiotikamodell, in dem sie sich als prädiktiv erwiesen haben. Sowohl die ARG- als auch die Antibiotika-Modellknoten sind entsprechend der Antibiotikaklasse, mit der das Antibiotikum/ARG bekanntermaßen assoziiert ist, farblich gekennzeichnet. Die ML-Modelle wurden für die folgenden Antibiotika durchgeführt: Amoxicillin-Clavulansäure (AMC), Amikacin (AMI), Aztreonam (AZM), Ceftazidim (CAZ), Ceftazidim-Clavulansäure (CAZ-C), Cefotaxim (CTX), Cefotaxim– Clavulansäure (CTX-C), Cefoxitin (CFX), Chloramphenicol (CHL), Cefepim (FEP), Gentamycin (GEN), Kanamycin (KAN), Minocyclin (MIN), Nalidixinsäure (NAL), Streptomycin (STR), Sulfafurazol (SUL) und Trimethoprim-Sulfamethoxazol (SXT). MDR, multiresistent.

Data Mining zeigte, dass eine Kernuntergruppe des Hühnerdarm-Resistoms (alle nachweisbaren ARGs aus den metagenomischen Daten des Hühnerkots) und der mikrobiellen Spezies (alle Bakterienarten aus den metagenomischen Daten des Hühnerkots) eine starke Vorhersagekraft für die E. coli-Resistenz aufwiesen. Dieser Kern bestand aus 419 Merkmalen (186 mikrobiellen Arten und 233 ARGs), die als starke Prädiktoren für die Resistenz/Anfälligkeit von E. coli gegenüber 10 Antibiotika fungierten (Abb. 3b, c und Ergänzungstabelle 9) mit einer AUC von über 0,90. Die 233 ARGs aus den Top-10-Antibiotikamodellen gehörten zu β-Lactamen (24 % der ARGs), Aminoglykosiden (18 %) sowie Makroliden, Lincosamiden und Streptogramin B (MLSB; 18 %), wobei andere Antibiotikaklassen weniger als ausmachten Jeweils 10 %. Basierend auf der Korrelation der ARG-Lesetiefe mit der Artenhäufigkeit (siehe Methoden)33 wurde festgestellt, dass 46 dieser 233 ARGs in Contigs vorhanden waren, bei denen festgestellt wurde, dass sie von E. coli stammen. Weitere 16 ARGs (von den 233) waren nur in Contigs vorhanden, die als andere Bakterienarten identifiziert wurden (d. h. sie stammten nicht von E. coli). Um die Beziehung zwischen Kernmerkmalen des Darms und Antibiotikaresistenzen weiter zu untersuchen, wurden die 419 Merkmale und 10 Antibiotikaresistenzen als Knoten eines Diagramms visualisiert, wobei die Kanten nur Prädiktoren mit vorhergesagten Resistenzen verbinden (Abb. 3c). Diese Analyse ergab einen Kern von 66 ARGs (15 klinisch relevant, darunter blaNDM-5, blaCTX-M-15, dfrA15 und dfra5), die als Prädiktoren für mehr als drei Antibiotikaresistenzen fungieren. Drei ARGs (aphA6, vat(A) und vgb(A)) erwiesen sich als Prädiktoren für acht Antibiotikaresistenzen. Dieselbe Analyse ergab 28 Mikrobenarten im Darm, die als Prädiktoren für fünf Antibiotikaresistenzen (Aztreonam, Chloramphenicol, Cefotaxim, Kanamycin und Nalidixinsäure) fungieren. Zu diesen 28 Arten gehörten neben anderen kommensalen Bakterien auch die Bakteriengattungen Arcobacter, Acinetobacter und Sphingobacterium.

Additive Erklärungswerte von Shapley wurden verwendet, um die von ML ausgewählten AMR-bezogenen Merkmale zu erklären (ergänzende Abbildung 8). Die zehn wichtigsten Merkmale, die gefunden wurden, um Resistenzen für jedes Antibiotikamodell vorherzusagen, zeigten, dass bei 41 % der Merkmale ihr Vorhandensein positiv mit der Vorhersage resistenter Phänotypen assoziiert war, während bei 59 % der Merkmale ihr Fehlen positiv mit der Vorhersage des resistenten Phänotyps assoziiert war insbesondere für die Antibiotika-Modelle Nalidixinsäure und Streptomycin. Umgekehrt waren acht der zehn wichtigsten Merkmale in jedem Modell negativ mit der Widerstandsvorhersage verbunden. Das Chloramphenicol-Antibiotikummodell wies die höchste Anzahl an ARGs auf, von denen bekannt ist, dass sie Resistenzen gegen dieselbe Antibiotikaklasse verleihen (Phenicol; optrA (Ref. 34), lsaE (Ref. 35) und mel (Ref. 35)) oder bekanntermaßen eine Resistenz dagegen fördern (oqxA (Lit. 36)).

Für die zehn besten Antibiotika-Modelle haben wir maßgeschneiderte Regressionsmodelle entwickelt, die einzelne Darmmerkmale als unabhängige Variablen (ein Modell pro Variable) und Temperatur oder Luftfeuchtigkeit als abhängige Variablen verwenden, um festzustellen, ob die Modellanpassung eine Korrelation hervorheben würde (siehe Phase III in Abb. 2 und). Methoden). Temperatur und Luftfeuchtigkeit wurden in allen Betrieben mit Ausnahme von Liaoning 1 (LN1) über einen gesamten Hühnerproduktionszyklus gemessen (Ergänzungstabelle 10 und Ergänzungsabbildung 9). Unter den ursprünglichen 419 Merkmalen korrelierten 130 ARGs und 48 Mikrobenarten mit der Luftfeuchtigkeit, während 39 ARGs und 20 Mikrobenarten mit der Temperatur korrelierten (Ergänzende Abbildung 10 und Ergänzende Tabelle 11). Die Korrelation mit der Luftfeuchtigkeit war im Durchschnitt stärker (höhere R2-Werte in der Regressionsanalyse, ergänzende Abbildung 10). Von den 130 ARGs, die mit der Luftfeuchtigkeit korrelierten, waren 22 % MLSB, 18 % β-Lactame, 17 % Aminoglykoside und 11 % Tetracycline. Von den 39 ARGs, die mit der Temperatur korrelierten, waren 23 % β-Lactame, 18 % MLSB, 15 % Aminoglykoside und 13 % Glykopeptide. Neunzehn ARGs korrelierten sowohl mit der Temperatur als auch mit der Luftfeuchtigkeit, vier davon waren klinisch relevant (qnrA1, qnrS2, blaNDM-1 und catA8). Vier mikrobielle Arten aus den Phyla Proteobacteria (Helicobacter pullorum und Alcaligenes faecalis), Firmicutes (Bacillus cereus-Gruppe) und Bacteroidetes (Bacteroides stercoris) korrelierten sowohl mit der Temperatur als auch mit der Luftfeuchtigkeit. Eine Art von Tenericutes (Mycoplasma yeatsii) korrelierte nur mit der Temperatur, während andere Arten von Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes und Actinobacteria entweder mit der Temperatur oder der Luftfeuchtigkeit korrelierten (Ergänzungstabelle 11).

Wir haben die Möglichkeit untersucht, dass einige ARGs, bei denen ein Zusammenhang mit Temperatur oder Luftfeuchtigkeit festgestellt wurde, möglicherweise zu mikrobiellen Arten gehören, die ebenfalls mit Temperatur und Luftfeuchtigkeit korrelieren. Dies erfolgte durch Korrelation der ARG-Lesetiefe mit der Lesetiefe mikrobieller Arten, wie von Tong et al.33 vorgeschlagen. Bei der Analyse wurden zwei unterschiedliche Teilgraphen hervorgehoben, die mit der Luftfeuchtigkeit korrelierten (Abb. 4a) und einer mit der Temperatur (Abb. 4b). Bemerkenswerterweise enthielt einer der mit der Luftfeuchtigkeit korrelierten Untergraphen Klebsiella pneumoniae und vier verwandte ARGs (kpnE, kpnF, kpnG und acrA). Der Untergraph, der A. faecalis und die ARGs vga(C) und blaOXA-58 enthält, wurde in beiden Analysen gefunden (d. h. er korrelierte sowohl mit der Temperatur als auch mit der Luftfeuchtigkeit).

a,b, Mikrobenarten und ARGs korrelieren mit Luftfeuchtigkeit (a) und Temperatur (b). Mikrobenarten und ARGs korrelieren mit der Luftfeuchtigkeit oder der Temperatur und auch untereinander, was darauf hindeutet, dass die ARGs wahrscheinlich in der Art vorhanden sind. Merkmale wurden als korreliert angesehen, wenn die Steigungen der linearen Regressionslinien signifikant von Null abwichen (P < 0,05 bei Verwendung eines zweiseitigen t-Tests). Knoten weisen auf ARGs oder mikrobielle Arten hin; Kanten verbinden Arten mit ARGs, die wahrscheinlich in der Art vorhanden sind. ARG-Knoten sind entsprechend der Antibiotikaklasse, von der bekannt ist, dass sie mit dem ARG assoziiert ist, farblich gekennzeichnet. Mikrobenartenknoten sind grau dargestellt.

Anschließend untersuchten wir, ob die ARG-Merkmale des Darms, die als Prädiktoren für die Resistenz bei E. coli identifiziert wurden und darüber hinaus mit der Luftfeuchtigkeit oder der Temperatur korrelierten, in unmittelbarer Nähe zu MGEs lagen. Zehn ARGs wurden in unmittelbarer Nähe zu MGEs gefunden (MLSB: optrA, mph(F) und erm(X); β-Lactame: blaNDM-1 und blaOXA-58; Amphenicol: catA8 und catB2; Aminoglycosid: aadA1; Fluroquinolon: qnrS2 und qnrA1). Es wurde festgestellt, dass drei der zehn ARGs mit nur einem MGE assoziiert waren (catB2 mit ISPa25, mph(F) mit IS15 und qnrA1 mit IS15), während die anderen sieben mit zwei bis neun verschiedenen MGEs assoziiert waren. Alle MGE-ARG-Paare wurden auf ihre konservierte Struktur über Farmen oder Quellen hinweg untersucht. Beispielsweise wurde das klinisch wichtige blaNDM-1 in unmittelbarer Nähe zu IS15 in vier Proben gefunden (drei Hühnerkot aus LN1 und eine Scheunenbodenprobe aus Liaoning 3 (LN3); ergänzende Abbildung 11). In 19 Proben aus Hühnerkot und Federproben von LN1, LN3, Shandong 2 (SD2) und Shandong 4 (SD4) wurde blaNDM-1 in der Nähe von MGE ISAba125 und neben einem anderen ARG, ble, gefunden, was eine bekannte Assoziation darstellt für Plasmid-übertragenes blaNDM-1 in Enterobacteriaceae-Arten aus asiatischen Regionen37. Obwohl in mehreren Betrieben (LN1, LN3, SD2 und SD4) das gleiche blaNDM-1-ISAba125-Muster gefunden wurde, gab es keine Hinweise auf eine Übertragung zwischen Betrieben (Abb. 5). Stattdessen deutete die evolutionäre Analyse der Contigs (unter Verwendung eines molekularen Uhrenmodells zur Vorhersage der Geschwindigkeit der molekularen Evolution in jedem Zweig des phylogenetischen Baums38) auf eine kürzliche Verzweigung der Isolate innerhalb einzelner Farmen hin (häufigster jüngster Vorfahre (MCRA) in den meisten Fällen weniger als 2 Jahre). Zweige) und viel frühere MRCAs zwischen verschiedenen Betrieben (länger als 20 Jahre), was auf die Wahrscheinlichkeit hinweist, dass dieses potenziell mobile ARG im Viehbestand in ganz China weit verbreitet ist.

Bayesianischer evolutionärer phylogenetischer Baum, der die Phylogenie von Contigs rekonstruiert, die das klinisch wichtige ARG blaNDM-1 und MGE ISABa125 enthalten. Proben-IDs (z. B. LNPCJFT2-17) werden unter dem phylogenetischen Baum angegeben. Die Art der Quelle und der Ort der Proben werden durch farbige Streifen angezeigt. Die Genstruktur jeder Probe wird unterhalb des Baums angezeigt, wobei MGEs blau, ARGs grün gefärbt und andere Gene gelb gefärbt sind. Das ARG-Ble ist in allen Contigs zusammen mit blaNDM-1 lokalisiert.

Wir untersuchten, ob das Kernmikrobiom des Hühnerdarms, das zuvor als Prädiktoren für die Resistenz bei E. coli identifiziert wurde, wiederum mit dem Einsatz von Antibiotika in landwirtschaftlichen Betrieben in Zusammenhang stehen könnte (gemessen daran, ob eine Antibiotikaklasse während des Untersuchungszeitraums auf dem Bauernhof verwendet wurde oder nicht, Ergänzungstabelle). 12; weitere Einzelheiten finden Sie in den Ergänzenden Informationen und in der ergänzenden Abbildung 12. Wir fanden heraus, dass die Verwendung von Tetracyclin, Lincosamid oder Aminoglycosid mit veränderten Zahlen für 21 ARGs und 20 Mikrobenarten verbunden war (Ergänzende Informationen). Wir fanden außerdem heraus, dass 20 der 21 ARGs, deren Zählwerte signifikant mit dem Einsatz von Antibiotika korrelierten (in der ergänzenden Abbildung 13 angegeben), auch mit der Luftfeuchtigkeit korrelierten. Darüber hinaus korrelierte eines dieser Gene, erm(X), auch mit der Temperatur. Von den 20 Mikrobenarten, bei denen ein statistisch signifikanter Unterschied in der relativen Häufigkeit in Bezug auf den Einsatz von Antibiotika festgestellt wurde (Ergänzungstabelle 13 und Ergänzungsabbildung 14), korrelierten 7 mit Änderungen der Luftfeuchtigkeit (Wohlfahrtiimonas chitiniclastica, Lachnoclostridium sp. An76, K . pneumoniae, Klebsiella variicola, Lysinibacillus sp. BF 4, Proteus hauseri und Proteus mirabilis), während vier mit Temperaturänderungen korrelierten (Alistipes sp. An66, Lactobacillus aviarius, Enterococcus cecorum und Enorma massiliensis), wobei die B. cereus-Gruppe mit beiden korrelierte Temperatur und Luftfeuchtigkeit.

Herkömmliche Ansätze zur AMR-Überwachung können die Bakterien- und Resistomenvielfalt sowohl innerhalb als auch zwischen Betrieben nicht genau beurteilen39. In unserer Studie verwendeten wir groß angelegte metagenomische Probenentnahmen und die Isolierung von E. coli in Kombination mit statistischen und ML-Methoden, um komplexe Korrelationen zu ermitteln, die AMR-Trends und -Muster zeigen. E. coli spielt eine etablierte Rolle als Referenzindikator für AMR26. Wir fanden heraus, dass 38 klinisch relevante ARGs mit einer Resistenz gegen mehrere Antibiotika korrelierten. Bei einigen dieser Antibiotika war bisher kein Zusammenhang mit diesen ARGs bekannt. Insbesondere 14 ARGs (aadA16, aph(3′)-Ia, aph(3′)-VIa, blaCARB-16, catQ, dfrA15, dfrA16, dfrA27, blaOXA-58, blaPER-1, qnrD1, tet(Z) , tet(39) und blaSHV-110), bei denen ein Zusammenhang mit einer Resistenz gegen die meisten Antibiotika festgestellt wurde, waren bereits in früheren Studien an Geflügel in China40,41,42 festgestellt worden, was unsere Methode bestätigt. Wir fanden jedoch eine Ansammlung von Darmbakterien, die gut mit der Resistenz von E. coli gegen fünf verschiedene Antibiotika korrelierte. Dazu gehörten Arcobacter (ein neu auftretender Zoonoseerreger, der durch Wasser und Lebensmittel übertragen wird und für Gastroenteritis beim Menschen verantwortlich ist43), Acinetobacter (kommensal im Geflügeldarm, kann jedoch sowohl bei Menschen als auch bei Geflügel extraintestinale Erkrankungen verursachen44) und Sphingobacterium (klinisch relevant bei Menschen und Tieren45). Dieses Ergebnis legt nahe, dass in Übereinstimmung mit früheren Studien12,29,46,47,48,49,50 eine ausschließliche Konzentration auf E. coli innerhalb des Betriebs zu Überwachungszwecken möglicherweise nicht so effektiv ist wie die Überwachung einer größeren Anzahl von Krankheitserregern.

In unserer Studie korrelierten die Betriebe, die Tetracycline, Lincosamide und Polypeptide verwendeten, positiv mit dem Vorhandensein von ARGs aus einem breiten Spektrum von Klassen, die über diejenigen hinausgingen, die für die ausgewählten Antibiotika spezifisch sind. Dies scheint mit früheren Erkenntnissen übereinzustimmen51,52, steht jedoch im Gegensatz zu einer aktuellen Studie aus den Vereinigten Staaten53. Es ist möglich, dass die Co-Lokalisierung von AMR-Genen eine wichtige Rolle bei der AMR-Selektion in unseren Betrieben spielt. Tatsächlich wurde die Co-Lokalisierung von AMR-Genen in bakteriellen Genomen von Nutztieren bereits früher beobachtet und als Lebensmittelsicherheitsrisiko in China54 sowie anderswo55,56 anerkannt.

Die Hühner in unserer Studie wurden in Ställen gehalten, die über kein wirksames Klimatisierungssystem verfügten und daher erheblichen Temperatur- und Feuchtigkeitsschwankungen ausgesetzt waren. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Kernmerkmale der Darmmikrobengemeinschaft und des Resistoms, die mit der Resistenz bei E. coli korrelieren, auch mit Änderungen der Temperatur und Luftfeuchtigkeit im Hühnerstall korrelieren. Unsere Ergebnisse bestätigen und erweitern die Erkenntnisse früherer Studien7,8,9,26,57. Bemerkenswert ist, dass die relative Häufigkeit von A. faecalis und den von dieser Art stammenden ARGs vga(C) und blaOXA-58 (durch Analyse von ARG und Artenlesetiefen) mit Veränderungen sowohl der Temperatur als auch der Luftfeuchtigkeit korreliert. Eine größere Häufigkeit von A. faecalis und schwerwiegendere klinische Symptome bei höherer Luftfeuchtigkeit wurden zuvor in einer Fall-Kontroll-Studie mit Truthähnen beobachtet, die bei unterschiedlichen Luftfeuchtigkeitsniveaus gehalten und mit A. faecalis geimpft wurden58. Dieses Bakterium kommt häufig bei Vögeln vor59 und würde normalerweise nicht durch herkömmliche Überwachung überwacht. Es gilt jedoch als neu auftretender Krankheitserreger, wurde mit Infektionen beim Menschen in Verbindung gebracht und gilt aufgrund seiner Fähigkeit, weitgehend medikamentenresistent zu werden, als schwierig zu behandeln60. In ähnlicher Weise wurde festgestellt, dass der wichtige opportunistische Erreger K. pneumoniae und vier ARGs (kpnE, kpnF, kpnG und acrA), die aus diesem Bakterium stammen und für die K. pneumoniae-Resistenz wichtig sind, mit Änderungen der Luftfeuchtigkeit korrelieren. K. pneumoniae kann durch Kontamination in der Luft übertragen werden und es wurde bereits früher festgestellt, dass es in Innenräumen mit hoher Luftfeuchtigkeit eine höhere Überlebensrate aufweist, was die Bedeutung der Untersuchung dieses Bakteriums in Innenräumen unterstreicht62. Die Zusammenhänge zwischen Umweltvariablen (die leicht zu überwachen und zu kontrollieren sind) und den Arten und Genen, die mit AMR assoziiert sind, bieten Chancen für die Entwicklung neuartiger AMR-Überwachungslösungen, insbesondere in LMICs, wo diese Variablen nicht kontrolliert werden und ein Risiko für die Tiere darstellen, denen sie ausgesetzt sind Veränderungen in ihnen.

Es wurde festgestellt, dass zehn potenziell mobile ARGs im Darmresistom mit der E. coli-Resistenz sowie mit Temperatur und Luftfeuchtigkeit korrelieren. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass 67 potenziell mobile ARGs mit der Resistenz und Luftfeuchtigkeit von E. coli korrelieren. Eines davon, das Gen cfr(C), das für eine ribosomale RNA-Methyltransferase kodiert, die Resistenz gegen Linezolid- und Phenicol-Antibiotika verleiht, wurde in der Nähe von ISEc9 (innerhalb von 5 kb) gefunden und ist mit CTX-M-Genen assoziiert63,64 (wie wir auch festgestellt haben). Der Zusammenhang von drfA16 mit der Transposase IS6100 wurde bisher nur in einer einzigen Studie mit einem Zusammenhang mit Corynebacterium diphtheriae, dem Erreger der kutanen Diphtherie, berichtet65. Diese Assoziationen deuten möglicherweise auf eine umweltspezifische Entwicklung dieser MGEs hin, wie bereits in früheren Arbeiten in Schweinehaltungsbetrieben angedeutet wurde, in denen gezeigt wurde, dass die Bedeutung von MGEs für AMR je nach Jahreszeit unterschiedlich ist66.

Auch wenn unsere Analyse auf einer großen Anzahl von Proben aus vielen heterogenen Quellen mit geografischen und saisonalen Schwankungen beruhte, beschränkte sich unser Anwendungsbereich auf E. coli, berücksichtigte keine menschlichen Proben und würde von einer Ausweitung der Analyse auf andere Indikatorarten wie Enterococcus67 profitieren. Räumliche und zeitliche Variationen in mikrobiellen Gemeinschaften und Resistomen in landwirtschaftlichen Betrieben/Schlachthöfen spiegeln sich in menschlichen Stuhlproben wider, wie unsere früheren Arbeiten und die anderer gezeigt haben26,68, aber ob diese Beobachtungen verallgemeinerbar und global wahr wären, ist derzeit unbekannt.

Die metagenomische Sequenzierung hat das Potenzial, unser Wissen über die Resistenz auslösenden Faktoren zu erweitern und die AMR-Überwachung zu verbessern69. Metagenomische Sequenzierungsdaten sind für die Entwicklung neuer Richtlinien zur Infektions- und Resistenzkontrolle von entscheidender Bedeutung, um das Bewusstsein für AMR zu schärfen und den optimalen Einsatz von Antibiotika durch Veterinärmediziner zu ermöglichen12,70. MGS ist vielversprechend für die AMR-Überwachung im Umweltbereich, aber die Methoden müssen standardisiert und Datenlücken geschlossen werden71,72, da derzeit nur wenige Labore und Länder über die Ressourcen und das Fachwissen verfügen, um MGS für die AMR-Überwachung einzusetzen73. Mit der weiteren Entwicklung könnten metagenomische und ML-Ansätze eingesetzt werden, um schnelle und zuverlässige Vorhersagen von AMR-Ausbrüchen, neu auftretenden Krankheitserregern und Übertragungswegen zu ermöglichen69.

Trotz der zunehmenden Verfügbarkeit kostengünstiger Präzisionslandwirtschaftstechnologien und Metagenomik29,74 müssen Innovationen und methodische Fortschritte weiterhin die Entwicklung von Überwachungslösungen ermöglichen, mit denen die AMR-Dynamik überwacht werden kann12,29. Arzneimittelresistenzen entstehen durch komplexe Wechselwirkungen zwischen ARBs, mikrobiellen Gemeinschaften, geografischen Nischen und Umgebungen, evolutionären Kräften, Klima und menschlichen Praktiken. Wir haben gezeigt, wie Methoden entwickelt werden können, die in der Lage sind, ein breites Spektrum mikrobieller Arten und Gene mit beobachtbarer AMR in Verbindung zu bringen, und haben weiter untersucht, wie diese mit den Umgebungsvariablen Temperatur und Luftfeuchtigkeit zusammenhängen. Die Berücksichtigung aller relevanten und miteinander verbundenen AMR-Datensätze in einem 360°-Ansatz wird unser Verständnis und die Kontrolle der AMR-Ausbreitung vorantreiben.

Diese Studie entsprach allen relevanten ethischen Vorschriften und wurde speziell in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die von der Ethikkommission des State Key Laboratory des China National Center for Food Safety Risk Assessment (ethische Zulassungsnummer: 2018018) genehmigt wurden. Die ethische Genehmigung wurde auch vom Research Ethics Committee der School of Veterinary Medicine and Science der University of Nottingham eingeholt (Antragsidentifikationsnummer: 2340 180613).

Für diese Studie haben wir zehn große kommerzielle Geflügelfarmen in drei verschiedenen Provinzen in China (Shandong, Henan und Liaoning; im Folgenden werden die Farmen als SDx, HNx bzw. LNx bezeichnet) ausgewählt, die jeweils eine Fläche von 472.500 km2 abdecken Einspeisung in einen von vier regionalen Schlachthöfen (zwei in Henan, einer in Liaoning und einer in Shandong). Jeder Betrieb verfügte über mehrere Ställe, wobei jeder Stall zwischen 12.000 und 32.800 Vögel beherbergte, was zu einer Gesamtproduktionskapazität von 110.730 bis 380.000 Vögeln pro Brutzyklus führte (je nach Betrieb). Die Masthähnchenproduktion basierte auf Selbstzucht mit auf dem Betrieb gezüchteten Masthähnchen, die in gleichaltrigen Chargen in die Ställe gebracht wurden. Von den zehn ausgewählten Betrieben verwendeten vier (drei in Liaoning und einer in Shandong) Netzhaltungssysteme, während die anderen sechs Käfighaltungssysteme verwendeten. Während der Sammlung unterschied sich die Anzahl der Vögel pro Stall zwischen den beiden Haltungssystemen nicht signifikant (t-Test, P = 0,07).

Bei der Probenahme wurden dieselben gepoolten Vögel über einen Brutzyklus hinweg beprobt, mit Ausnahme einer Farm in der Provinz Shandong (Shandong 1), die über zwei Zyklen hinweg beprobt wurde, um eine Pilotstudie zur Feinabstimmung der Sammelkampagne und der Datenanalyseprotokolle durchzuführen26. Biologische Proben wurden in jedem Zuchtzyklus (einschließlich beider Zyklen in Shandong 1) zu den gleichen drei Zeitpunkten gesammelt: t1 (Woche 3), t2 (Woche 6) und t3 (1–5 Tage nach Woche 6). Biologische Proben bestanden aus gepoolten Fäkalien und Federn (nicht unbedingt von denselben Tieren) aus dem Kot lebender Vögel in den Ställen, die unmittelbar nach der Ausscheidung in der Lebensmitte (t1) und am Lebensende (t2) vom Stallboden gesammelt wurden der Tiere sowie Proben vom Stallboden (Einstreu), die zu den gleichen Zeitpunkten gesammelt wurden. In den Schlachthöfen wurden am Schlachttag (t3) Proben aus Schlachtkörpern, Fleischverarbeitungsflächen (sogenannte Verarbeitungslinie) und Abwasser entnommen. Zu t1 und t2 wurden Bodenproben aus Außenbereichen rund um die Farmen entnommen. Einzelheiten zu den Sammelmethoden finden Sie in den Zusatzinformationen.

Alle an dieser Studie beteiligten Betriebe waren mit Heizungs-/Klimaanlagen ausgestattet. Umgebungssensordaten (Temperatur und Luftfeuchtigkeit) wurden in Abständen von 5 Minuten mithilfe der in den meisten Betrieben verfügbaren automatischen Sensoren und Datenlogger (HN1, HN2, HN3, SD2, SD3 und SD4) erfasst. Drei Betriebe (SD1, LN2 und LN3) waren nicht mit automatisierten Lösungen ausgestattet und manuelle Messungen wurden mit SMART SENSOR AS837 Temperatur-/Feuchtigkeitsgeräten entweder täglich oder alle 6 Stunden durchgeführt. Farm LN1 hatte technische Probleme mit dem Sensor und konnte keine Messwerte erfassen. In allen Fällen wurden die Temperatur- und Luftfeuchtigkeitsdaten über drei Messungen gemittelt, die an verschiedenen Stellen im Stall durchgeführt wurden.

Die DNA-Extraktion wurde an Kot-, Stallboden- und Außenbodenproben unter Verwendung eines genomischen DNA-Extraktionskits mit Magnetkügelchen (DOP336-T3, TIANGEN Biotech) durchgeführt. Für Schlachtkörperproben wurde die Cetyltrimethylammoniumbromid-Methode75 verwendet. Für den Aufbau der DNA-Bibliothek wurden Proben mit einem DNA-Gehalt über 1 µg verwendet. Die DNA-Konzentration wurde mit einem Qubit dsDNA Assay Kit und einem Qubit 2.0-Fluorometer (LifeTechnologies) gemessen, und die Integrität wurde mit 1 % Agarosegelelektrophorese gemessen. Als Ausgangsmaterial für die DNA-Probenvorbereitungen wurde eine Gesamtmenge von 1 μg DNA pro Probe verwendet. Sequenzierungsbibliotheken wurden mit dem NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit für Illumina (NEB) erstellt. Die DNA-Probe wurde in 350 bp fragmentiert, und dann wurden die DNA-Fragmente endpoliert, mit einem A-Schwanz versehen und mit dem Volllängenadapter für die Illumina-Sequenzierung mit weiterer PCR-Analyse ligiert. Abschließend wurden die PCR-Produkte gereinigt (AMPureXPsystem) und die Bibliotheken mit einem Agilent2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) auf Größenverteilung analysiert und mittels Echtzeit-PCR quantifiziert. Nach der Clustergenerierung wurden die Bibliotheksvorbereitungen auf einer Illumina Novaseq 6000-Plattform sequenziert und 150 bp Paired-End-Reads erstellt.

Die von der Illumina HiSeq-Sequenzierungsplattform erhaltenen Rohsequenzablesungen wurden mit Readfq (V8, https://github.com/cjfields/readfq) vorverarbeitet und gefiltert, um hochwertige Daten für die anschließende Analyse zu erfassen. Die Wirts-DNA wurde mit Bowtie 2 (v2.3.4.1)76 und SAMtools (v1.9 (Ref. 77); Referenzgenom-Zugangscode: GCF_000002315.6) gefiltert. Die Mikrobiome der Proben wurden konstruiert, indem die Metagenom-Sequenzierungsdaten für die verschiedenen Probenquellen (Hühnerkot, Hühnerfedern, Hühnerkadaver, Stallboden, Außenboden, Abwasser und Verarbeitungslinie) separat mithilfe von Binning- und Dereplikationspipelines zusammengestellt wurden26,78. Zum Zusammenstellen der Sequenzen wurde die Software MEGAHIT (v1.1.2)79 verwendet. Für alle Proben wurden einzelne Probenbaugruppen mit MEGAHIT-Standardparametern generiert. Für jede Probenquellengruppe (Hühnerkot, Hühnerfedern, Hühnerkadaver, Stallboden, Außenboden, Abwasser und Verarbeitungslinie) wurden Co-Zusammenstellungen erstellt, jeweils mit den MEGAHIT-Einstellungsparametern „--continue --kmin-1pass --min -contig-len 1000“, wie zuvor für Co-Assemblies verwendet78. Gefilterte Contigs (>2.000 bp) wurden mithilfe von Burrows–Wheeler Aligner–Maximal Exact Match (BWA-MEM v2-2.1)80 und SAMtools (v1.9)77 einzelnen Baugruppen und Co-Baugruppen zugeordnet, um die Binary Alignment Map (BAM) zu erstellen ) Dateien. METABAT2 (v2.15)81 wurde verwendet, um die Abdeckungstiefe zu ermitteln. Die taxonomische Klassifizierung und Zusammensetzung (relative Artenhäufigkeit) der Metagenom-Reads wurden mit MetaPhlAn (v3.0)82 mit Bowtie 2 (v2.3.4.1)76 unter Verwendung der Standardeinstellungen –bowtie2out–input_type fastq profiliert. Eine nichtmetrische mehrdimensionale Skalierung (NMDS) der relativen Artenhäufigkeit wurde in R (v3.6.2) unter Verwendung des vegan83-Pakets mit Bray-Curtis-Unähnlichkeit durchgeführt. Die Varianzanalyse wurde in R unter Verwendung von PERMANOVA aus dem veganen Paket83 mit paarweisem Testen unter Verwendung der paarweisen Adonis-Funktion84 mit Holm-Korrektur für mehrere Vergleiche durchgeführt. Die relativen Häufigkeiten wurden visuell analysiert, indem Violindiagramme und kategoriale Streudiagramme kombiniert wurden, und die Unterschiede wurden durch einen Wilcoxon-Rangsummentest mit Holm-Korrektur (angepasstes P = 0,05) bewertet.

Da die Sequenzierungstiefe die beobachtete Diversität bei der Genomsequenzierung beeinflussen kann, wird die Verdünnung häufig zur Normalisierung von Proben vor der Analyse verschiedener Probentypen eingesetzt85. Der Einsatz der Verdünnung ist jedoch umstritten, da die Unterbeprobung zum Verlust der in der nichtverdünnten Probe verfügbaren Informationen führt86. Daher haben wir in dieser Studie verdünnte Daten nur dort verwendet, wo dies erforderlich war (um verschiedene Probentypen zu vergleichen) und nicht verdünnte Daten, wenn nur ein einziger Probentyp berücksichtigt wurde. Vom Host entfernte Lesevorgänge wurden mithilfe von seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) mit der minimalen Probentiefe verdünnt, wobei der zufällige Startwert für jedes Lesepaar festgelegt wurde.

Zusammengesetzte Genome wurden auf Sequenzähnlichkeit mit annotierten ARGs in der Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD)61 unter Verwendung des Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotid (BLASTn)87 ​​mit einem Identitätsschwellenwert von 95 % und einem Abdeckungsschwellenwert von 95 % (strengere Schwellenwerte mit) durchsucht im Vergleich zu unserer vorherigen Studie26), um die Wahrscheinlichkeit falsch gekennzeichneter ARG-Varianten zu minimieren. Die NMDS-Analyse wurde an der resultierenden Genzahlmatrix im veganen R-Paket83 unter Verwendung der Bray-Curtis-Unähnlichkeit durchgeführt. Vergleiche wurden anhand (1) der Gesamtzahl der pro Probe vorhandenen ARGs, (2) der tatsächlichen Anzahl der einzelnen ARGs pro Probe und (3) der relativen ARG-Häufigkeit pro Antibiotikaklasse gemäß CARD (der Anzahl der in der Probe vorhandenen ARGs) durchgeführt geteilt durch die Gesamtzahl der ARGs in dieser Klasse). Diese drei Ansätze wurden visuell analysiert, indem Violindiagramme und kategoriale Streudiagramme kombiniert wurden, und die Unterschiede wurden durch einen Wilcoxon-Rangsummentest mit Holm-Korrektur (angepasstes P = 0,05) bewertet.

Um die Quellbakterien zu identifizieren, aus denen die ARGs stammen, wurden in Übereinstimmung mit einer früheren Studie33 verdünnte Lesevorgänge aus jeder Metagenomprobe mit BWA-MEM (v2-2.1)80 und SAMtools (v1.9)77 auf ihre einzelnen Baugruppen abgebildet. Die durchschnittlichen Tiefen wurden den ARG-tragenden Contigs und ARGs zugeordnet. Die Abdeckung von ARGs, normalisiert durch Gen-/Contig-Länge33, wurde dann verwendet, um mit dem Spearman-Korrelationstest mit der Artenhäufigkeit zu korrelieren. ARG-Arten-Paare wurden als signifikant korreliert angesehen, wenn P < 0,05 und der Pearson-Korrelationskoeffizient ≥ 0,6 war.

Um nach potenziell mobilen ARGs zu suchen, die über verschiedene Quellen verteilt sind, wurden ARGs berücksichtigt, die sowohl von der Umwelt als auch von Hühnern übertragen werden. Gefilterte Contigs (> 500 bp) in jeder Baugruppe wurden mithilfe einer BLASTn-Suche in den Datenbanken CARD61 und ISfinder (https://isfinder.biotoul.fr/) unter Verwendung eines Identitätsschwellenwerts von 95 % und eines Abdeckungsschwellenwerts von 95 nach ARGs und MGEs durchsucht % um Fehlalarme und Variantenunsicherheit zu verhindern88. Der Abstand zwischen einem ARG und einem MGE wurde aus den Positionen des ARG und des MGE im Contig26 berechnet. ARG-tragende Contigs mit einem Abstand von mehr als 5 kb zwischen ARG und MGE wurden verworfen68,89,90,91, wobei die verbleibenden Contigs als potenziell mobile ARGs eingestuft wurden. Contigs wurden mit Prokka (v1.14.6)92 kommentiert. Potenziell mobile ARG-Muster, die nur in einer einzigen Probe gefunden wurden, wurden bei der Analyse nicht berücksichtigt. ARGs wurden weiterhin als klinisch wichtig eingestuft, wenn die ARG gemäß Zhang et al. in die Risiko-I-Kategorie (klinisch wichtiger ARGs-Datensatz) aufgenommen wurden.30. Diese Gene wurden als Risiko I eingestuft, wenn sie (1) in mit Menschen assoziierten Umgebungen vorhanden waren, (2) potenziell mobile Gene waren und (3) in ESKAPE-Krankheitserregern (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa usw.) vorhanden waren Enterobacter-Arten). Die Strukturen der potenziell mobilen ARG-Muster (MGE-Typ, getragenes ARG, getragenes MGE, Probenquelle, Betrieb, Anzahl der Proben, die potenziell mobiles ARG tragen, und Entfernung) sind in der Ergänzungstabelle 8 zusammengefasst. Für ISAba125–blaNDM-1 die Genstruktur wurde mit EasyFig93 visualisiert.

Die evolutionäre Phylogenie wurde für Contigs, die das potenziell mobile ARG ISABa125–NDM-1 tragen, mit BEAST (v1.10.4)38 rekonstruiert. Alle Kombinationen von drei Uhrenmodellen (streng, unkorreliertes logarithmisches Normal und unkorreliertes exponentielles Modell) und drei Baum-Prioritäten (konstante Koaleszenz, logistisches Wachstum und Bayes'sche Skyline) wurden mithilfe von Stepping-Stone-Stichproben an den Contigs getestet, um das beste Modell zu ermitteln. Als bestes Modell erwies sich ein zufälliges, unkorreliertes Log-Normal-Uhrenmodell mit einem Bayes'schen Skyline-Wachstumsmodell. Es wurde das GTR-Gamma-Nukleotid-Substitutionsmodell verwendet, ausgewählt durch eine Maximum-Likelihood-Baumanalyse in IQ-tree2 (v2.0.6) unter Verwendung einer automatisierten Modellauswahl94. Die Analyse wurde für drei unabhängige Ketten durchgeführt, bis die effektive Stichprobengröße, d. h. die effektive Anzahl unabhängiger Entnahmen aus der hinteren Verteilung, für alle Parameter mehr als 200 pro Kette betrug. Dabei musste jede Kette 100 Millionen Schritte durchlaufen. Die Konvergenz wurde in Tracer (v1.7.1)95 bewertet und Ketten wurden anschließend mit LogCombiner (v1.10.4)96 kombiniert. Der maximale Clade-Glaubwürdigkeitsbaum wurde mit TreeAnnotator (v1.10.4) ausgewählt und dann in iTOL (v5)97 visualisiert.

E. coli-Stämme wurden aus denselben Proben wie die Metagenomdaten des Hühnerdarms entnommen und kultiviert und als Indikatorspezies für AMR98 für jede Hühnerkotprobe verwendet (Einzelheiten zur Kultur und AST-Methodik finden Sie in den Ergänzenden Informationen). Nur 191 der 223 Proben waren positiv für ein E. coli-Isolat. Von diesen 191 Proben wurden weitere 21 (von LN1) aus dieser Analyse verworfen, da technische Probleme mit den Umgebungssensoren dazu führten, dass diese Proben nicht über die für die ML-Pipeline erforderlichen Temperatur- und Feuchtigkeitsdaten verfügten. Daher mussten noch 170 Proben von der ML-Pipeline analysiert werden.

Die Antibiotika-Empfindlichkeits-/Resistenzprofile der E. coli-Stämme wurden anhand einer Gruppe von 26 Antibiotika (Ergänzungstabelle 1) unter Verwendung von Bouillon-Mikroverdünnung bewertet und gemäß den Kriterien des Clinical and Laboratory Standards Institute99 interpretiert. Die gesamte Datenanalyse-Pipeline, implementiert in Python (v3.9.15)100 und SciPy (v1.9.3)101, bestand aus drei Phasen (Abb. 2):

Phase I: Vorauswahl metagenomischer Merkmale. Für jedes Antibiotikum erfolgt die Isolierung eines ersten Satzes von fäkalen Metagenommerkmalen (d. h. ARG-Anzahl und relative Häufigkeit mikrobieller Spezies), die auf der Grundlage eines Chi-Quadrat-Tests eine Korrelation mit den Resistenz-/Anfälligkeitsprofilen von E. coli zeigen.

Phase II: Bewertung der Merkmalsvorhersageleistung durch die Entwicklung ML-gestützter Vorhersagefunktionen. Entwicklung ML-basierter Vorhersagefunktionen für Resistenz/Anfälligkeit (eine Vorhersagefunktion pro Antibiotikum), die auf den vorab ausgewählten Merkmalen basieren (weitere Einzelheiten siehe unten), überwachtes Training mit verfügbaren Proben und anschließende Überprüfung des jeweils besten Anpassungszustands Vorhersagefunktion, um den prädiktiven Einfluss jedes Merkmals abzurufen, d. h. das relative Gewicht des Merkmals bei der Steuerung des Vorhersageergebnisses.

Phase III: Bewertung der Merkmalsabhängigkeit von Temperatur/Luftfeuchtigkeit durch die Entwicklung ML-gestützter Regressoren. Entwicklung ML-basierter Regressoren zur Identifizierung von Korrelationen zwischen den in Phase II identifizierten fäkalen Metagenommerkmalen und den Temperatur-/Feuchtigkeitsbedingungen.

Nachfolgend werden die drei Phasen im Detail beschrieben.

Für jedes der 26 Antibiotika wurde ein erster Satz von Merkmalen berücksichtigt, der alle Daten zur ARG-Anzahl und zur Häufigkeit mikrobieller Arten im fäkalen Metagenom umfasste. Die folgenden Schritte wurden angewendet, um solche Mengen mithilfe des Python-Pakets Scikit-learn102 zu verarbeiten und zu reduzieren:

Die Häufigkeiten wurden mithilfe der Min-Max-Normalisierung in relative Häufigkeiten (Bereich 0–1) umgewandelt.

Für jedes spezifische Antibiotikum wurden Ungleichgewichte in der Stichprobengröße zwischen Resistenz- und Anfälligkeitsbeobachtungen durch synthetisch generierte Daten unter Verwendung der Synthetic Minority Oversampling-Technik (SMOTE)103 ausgeglichen, wobei die fünf nächsten Nachbarn als Standardparameter übernommen wurden.

Merkmale (ARG-Anzahl und relative Artenhäufigkeit) mit einer Varianz von Null (d. h. Merkmale, die in allen Stichproben den gleichen Wert hatten) wurden als redundant (nicht in der Lage, als wirksame Prädiktoren zu fungieren) entfernt.

Merkmale, die laut einem Chi-Quadrat-Test keinen starken Zusammenhang mit dem Vorhersageergebnis (Resistenz-/Anfälligkeitsprofil) zeigten, wurden entfernt (alle Merkmale mit einem P-Wert größer als 0,01 wurden entfernt). Es wurde keine mehrfache Vergleichskorrektur verwendet, da wir jedes Merkmal für sich bewerten wollten104.

Der verbleibende Satz an Merkmalen wurde einer visuellen Inspektion mittels einer grafischen Darstellung unterzogen, um räumliche Cluster zu erstellen, die die Korrelation hervorheben. Die Analyse wurde mit der NetworkX105-Bibliothek in Python durchgeführt. Im resultierenden Diagramm werden Knoten, die Merkmale darstellen (ARG-Anzahl oder relative Artenhäufigkeit), mit Knoten verbunden, die Resistenz/Anfälligkeit gegenüber einem bestimmten Antibiotikum darstellen, wenn das Vorhandensein einer Korrelation durch den Chi-Quadrat-Test nachgewiesen wurde (siehe vorheriger Schritt). . Die Knoten wurden mithilfe der Kamada-Kawai-Pfadlängenkostenfunktion räumlich angeordnet106.

Es wurden Vorhersagefunktionen entwickelt und getestet, die auf mehreren zugrunde liegenden ML-Technologien basieren und jeweils darauf trainiert wurden, die Resistenz/Anfälligkeit gegenüber einem bestimmten Antibiotikum vorherzusagen. Dabei wurden die in Phase I vorab ausgewählten Funktionen als Input für überwachtes Lernen verwendet. Für jedes der 26 getesteten Antibiotika wurde eine Vorhersagefunktion trainiert und validiert. Nach erfolgreichem Training und Validierung ermöglichte die Überprüfung des Best-Fit-Status jeder Vorhersagefunktion die Ermittlung des quantitativen Einflusses jedes Merkmals (d. h. des relativen Gewichts) in Bezug auf die Vorhersage der Resistenz/Anfälligkeit für jedes Antibiotikum.

Die folgenden ML-Technologien wurden für die Implementierung der Vorhersagefunktionen getestet: logistische Regression, lineare Support-Vektor-Maschine, radiale Basisfunktions-Support-Vektor-Maschine, zusätzlicher Baumklassifikator, Random Forest, Adaboost und XGBoost, alle implementiert mit dem Python-Paket Scikit-learn102. Mithilfe der verschachtelten Kreuzvalidierung (NCV)107 wurde die Leistung bewertet und die optimalen Hyperparameter für jede Technologie ausgewählt. NCV ist ein iteratives Verfahren, bei dem verschiedene Konfigurationen der Vorhersagefunktion (d. h. verschiedene Hyperparameter, die die ausgewählte Technologie steuern) wiederholt auf ihre Leistung getestet werden, während die Trainings- und Testsätze neu gemischt werden. NCV besteht aus einer äußeren Schleife, die der zufälligen Neuzuordnung von Beobachtungen in neue Trainings- und Testsätze dient, und einer inneren Schleife, in der verschiedene Konfigurationen (Sätze von Hyperparametern) für die Vorhersagefunktion mit dem aktuellen Trainings- und Testsatz getestet werden. In unserer Analyse haben wir einen NCV mit einer fünffachen Außenschleife (fünf Umgruppierungen der Trainings- und Testsätze) und einer dreifachen Innenschleife (drei Umgruppierungen der Trainingssätze) für jede unterschiedliche ML-Technologie ausgeführt. Die Vorhersageleistung wurde über den charakteristischen Bereich des Empfängerbetriebs unter der Kurve (ROC-AUC, im Folgenden einfach als AUC bezeichnet), Genauigkeit, Empfindlichkeit, Spezifität und Präzision gemessen, die alle bei jeder Iteration der äußeren Schleife berechnet wurden108. Für jede ML-Technologie wurden 30 Iterationen der NCV-Bewertungen durchgeführt. Anschließend wurden die Technologien verglichen, indem anhand der AUC-Metrik ein F-Test der mittleren quantitativen Ergebnisse für jede durchgeführt wurde. Für die Klassifizierung für SMOTE und NCV waren mindestens 12 Proben in der Minderheitenklasse erforderlich. Für neun Antibiotika (Ampicillin, Ampicillin-Sulbactam, Cefazolin, Ciprofloxacin, Doxycyclin, Imipenem, Levofloxacin, Meropenem und Tetracyclin) fehlten in einer Klasse genügend Proben, um eine Kreuzvalidierung und SMOTE zu ermöglichen, und wurden daher nicht weiter untersucht. Wir haben die sieben ML-Architekturen verglichen, um Verzerrungen in der Analyse im Zusammenhang mit der Auswahl einer bestimmten ML-Technologie zu vermeiden. Die Vorhersageleistung wurde mithilfe von 30 NCV-Iterationen gemessen, wobei der endgültige Leistungswert als Mittelwert aller Durchläufe definiert wurde. Der Nemenyi-Test wurde verwendet, um zu überprüfen, welche Vorhersagefunktion von den sieben ML-Methoden die beste Leistung erbrachte. Die Extra-Tree-Vorhersagefunktionen schnitten bei allen untersuchten Leistungsindikatoren mit Ausnahme der Sensitivität (wo alle Vorhersagefunktionen als statistisch gleichwertig angesehen wurden) am besten ab und wurden schließlich zur Erstellung der Korrelationsergebnisse ausgewählt. Da die Extra-Tree-Methode zur Unterstützung der endgültigen Vorhersagefunktionen ausgewählt wurde, wurde die Gini-Wichtigkeit verwendet, um die stärksten Prädiktoren aus den endgültigen, trainierten Modellen zu extrahieren.

Die letzte Phase der Analyse bestand aus der Entwicklung von Regressionsmodellen, um Korrelationen zwischen den in Phase II identifizierten fäkalen Metagenommerkmalen (Prädiktoren) und den Temperatur-/Feuchtigkeitsbedingungen zu identifizieren. Es wurden nur die aus ML-gestützten Modellen mit AUC > 0,9 extrahierten Prädiktoren berücksichtigt.

Es wurde ein separates Regressionsmodell erstellt, um die Beziehung jedes Prädiktors (als Eingabe-/Erklärungsvariable betrachtet) mit der Temperatur oder der Luftfeuchtigkeit (als abhängige Variable betrachtet) darzustellen. Der Prädiktor wurde als kontinuierlich behandelt, wenn er entweder mit der relativen Mikrobenhäufigkeit oder der ARG-Anzahl in Zusammenhang stand. In jedem Betrieb wurden Temperatur- und Luftfeuchtigkeitswerte erfasst und aus den sieben Tagen vor den beiden Zeitpunkten t1 und t2 gemittelt.

Jedes Regressionsmodell wurde mithilfe der linearen Anpassung der kleinsten Quadrate (unter Verwendung des Python-Pakets SciPy101) unter Verwendung des Bestimmtheitsmaßes (r2) entwickelt, um die Güte der Anpassung zu bewerten. Es wurde davon ausgegangen, dass Metagenommerkmale signifikant mit Temperatur oder Luftfeuchtigkeit korrelierten, wenn die Steigung der Regressionslinie statistisch von Null abwich (P < 0,05 unter Verwendung des Wald-Tests mit t-Verteilung der Teststatistik). Wir suchten nach Korrelationen zwischen der ARG-Lesetiefe und der Arten-Lesetiefe, die auf die Wahrscheinlichkeit hinweisen würden, dass ARGs von einer bestimmten Art stammen, wie von Tong et al.33 vorgeschlagen. Mit NetworkX (v2.8.4)105 wurde ein ungerichtetes Diagramm erstellt, um die miteinander verbundenen ARGs und Arten zu visualisieren, die vom Regressionsrahmen für Luftfeuchtigkeit und Temperatur ausgewählt wurden.

Die beobachteten Korrelationen zwischen den metagenomischen Daten im Hühnerkot und den in E. coli beobachteten Resistenzprofilen können durch die unterschiedlichen Antibiotikaprotokolle beeinflusst werden, die jeder Betrieb anwendet (Ergänzungstabelle 13). Um festzustellen, ob die Unterschiede in der Antibiotikabehandlung in den einzelnen Betrieben zu einer Verzerrung der ausgewählten metagenomischen Merkmale führten, berechneten wir die relative Häufigkeit der ausgedrückten ARGs, indem wir zunächst die ARGs nach ihrer Beziehung zu jedem spezifischen Antibiotikum gruppierten und dann die Verhältnisse der in der Probe vorhandenen ARGs berechneten , dividiert durch die Gesamtzahl der ARGs für jedes Antibiotikum und berechnete dann die relative Häufigkeit der mikrobiellen Spezies. Für diese drei Fälle verwendeten wir den Wilcoxon-Rangsummentest, um zu überprüfen, ob es einen Unterschied zwischen den Proben von Betrieben, die ein Antibiotikum erhielten, und den Proben, die dieses Antibiotikum nicht erhielten, gab.

Einzelheiten zu allen statistischen Analysen finden Sie in den Zusatzinformationen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die metagenomischen Sequenzierungsdaten, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels stützen, sind in der NCBI-Datenbank unter den Bioprojekt-Zugangsnummern PRJNA678871 (für Shandong 1_1 und 1_2) und PRJNA841806 (für alle anderen Betriebe) verfügbar. Darüber hinaus ist das zum Filtern der Wirts-DNA verwendete Referenzgenom in der NBCI-Datenbank unter dem Zugangscode GCF_000002315.6 verfügbar. Alle zur Wiederherstellung der Zahlen erforderlichen Quelldaten sind in den Zusatzdaten 1 enthalten.

Der Code ist über Github unter https://github.com/tan0101/Commercial_MGS2023 verfügbar. Der Code wurde für die Klassifizierung des maschinellen Lernens, die Regressionsanalyse und die Netzwerkanalyse verwendet.

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Diese Arbeit wurde von InnovateUK (Fördernummer 104986), FARMWATCH: Fight AbR with Machine learning and a Wide Array of sensor TeCHnologies (TD and DR) und dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Volksrepublik China durch den Grant Key unterstützt Projekt der internationalen wissenschaftlichen und technologischen Innovationskooperation zwischen Regierungen (Nummer 2018YFE0101500, ZP). Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerfassung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.

Die Autoren danken dem University of Nottingham Research Beacon of Excellence: Future Food und dem Überwachungsbeauftragten von Innovate UK, L. Viatge, für ihre Unterstützung.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Michelle Baker, Xibin Zhang, Alexandre Maciel-Guerra.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Zixin Peng, Fengqin Li, Tania Dottorini.

School of Veterinary Medicine and Science, University of Nottingham, Sutton Bonington, Großbritannien

Michelle Baker, Alexandre Maciel-Guerra, Yue Hu und Tania Dottorini

Shandong New Hope Liuhe Group Co. Ltd und Qingdao Key Laboratory of Animal Feed Safety, Qingdao, Volksrepublik China

Xibin Zhang

NHC Key Laboratory of Food Safety Risk Assessment, China National Center for Food Safety Risk Assessment, Peking, Volksrepublik China

Yinping Dong, Wei Wang, Yujie Hu, Junshi Chen, Zixin Peng und Fengqin Li

Nimrod Veterinary Products Ltd., Moreton-in-Marsh, Großbritannien

David Renney

Shandong Kaijia Food Co., Weifang, Volksrepublik China

Longhai Liu

Luoyang-Zentrum für Krankheitskontrolle und Prävention, Stadt Luoyang, Volksrepublik China

Hui Li & Zhiqin Tong

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Meimei Zhang & Yingzhi Geng

Agrarbiopharmazeutisches Labor, Hochschule für Chemie und Pharmazeutische Wissenschaften, Qingdao Agricultural University, Stadt Qingdao, Volksrepublik China

Li Zhao

Chinesisches Innovationszentrum für Veterinärmedizin, Hochschule für Veterinärmedizin, China Agricultural University, Stadt Peking, Volksrepublik China

Zhihui Hao

Fakultät für Ingenieurwissenschaften, Universität Perugia, Perugia, Italien

Nicola Deine

Zentrum für intelligente Lebensmittelforschung, Nottingham Ningbo China Beacons of Excellence Research and Innovation Institute, Universität Nottingham Ningbo China, Ningbo, Volksrepublik China

Tania Dottorini

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JC, FL, ZP, XZ, LL und TD haben die Studie entworfen und überwacht; ZP, XZ, LL, FL, JC und TD planten die Methodik; MB, AMG, NS und TD haben den Entwurf geschrieben; ZP, JC, FL, MB, AMG, NS und TD haben den Entwurf bearbeitet und überprüft und kritische Kommentare abgegeben; ZP, WW, YD, Yujie Hu, HL, ZT, MZ, YG, LZ, ZH und XZ führten die Experimente durch und sammelten die Tier- und Umweltproben; AMG, MB und Yue Hu führten die Datenanalyse und Visualisierung der analysierten Daten mit kritischen Kommentaren von NS und TD durch; ZP, DR und TD haben die Finanzierung übernommen. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Zixin Peng, Fengqin Li oder Tania Dottorini.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Food dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Ergänzende Forschungsziele, Ergebnisse, Methoden, Abb. 1–14 und Tabellenverzeichnis.

Ergänzungstabellen 1–13.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Baker, M., Zhang, X., Maciel-Guerra, A. et al. Maschinelles Lernen und Metagenomik offenbaren gemeinsame antimikrobielle Resistenzprofile in mehreren Hühnerfarmen und Schlachthöfen in China. Nat Food 4, 707–720 (2023). https://doi.org/10.1038/s43016-023-00814-w

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Eingegangen: 09. Januar 2023

Angenommen: 07. Juli 2023

Veröffentlicht: 10. August 2023

Ausgabedatum: August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43016-023-00814-w

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