Wirksamkeit der Gewebeproduktion

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 13737 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bioreaktorsysteme sind sehr wertvolle Werkzeuge zur Erzeugung lebender Knochentransplantate in vitro. Ziel dieser Studie war es, die Wirksamkeit von Rotations- und Perfusionsbioreaktoren bei der Herstellung eines lebenden Knochenkonstrukts zu vergleichen. Aus menschlichem Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen (BMDSCs) wurden auf die Oberflächen von Gerüsten auf Hydroxylapatitbasis ausgesät und 21 Tage lang unter drei verschiedenen Bedingungen kultiviert: (1) statische 3D-Kultur, (2) 3D-Kultur in einem Perfusionsbioreaktor und ( 3) dynamische 3D-Kultur in einem rotierenden Bioreaktor. Die quantitative Auswertung der Zellzahl zeigte, dass die Kultivierung im Perfusionsbioreaktor die Zellproliferation im Vergleich zum rotierenden Bioreaktor und der statischen Kultur deutlich reduzierte. Der osteogene Differenzierungstest zeigte, dass im rotierenden Bioreaktor kultivierte BMDSCs im Vergleich zu den im Perfusionsbioreaktor kultivierten Zellen eine deutlich größere Menge an Osteopontin produzierten. Darüber hinaus zeigte die Raman-Spektroskopie, dass die Kultivierung von BMDSCs im rotierenden Bioreaktor die Mineralisierung der extrazellulären Matrix (ECM) verstärkte, die durch kohlensäurehaltige Substitution vom B-Typ von Hydroxylapatit (assoziiert mit PO43−-Gruppen) und ein höheres Mineral-zu-Matrix-Verhältnis im Vergleich zur ECM gekennzeichnet war von im Perfusionssystem kultivierten Zellen. Daher wurde der Schluss gezogen, dass der rotierende Bioreaktor bei der Erzeugung von Knochengewebekonstrukten in vitro viel wirksamer war als der Perfusionsbioreaktor.

Im Laufe der Jahre hat das Knochengewebe-Engineering (HdO) in klinischen Anwendungen zur Wiederherstellung von Knochendefekten zunehmend an Interesse gewonnen. Es wurde beobachtet, dass BTE zahlreiche Nachteile natürlicher Knochentransplantate (Autotransplantate, Allotransplantate und Xenotransplantate) überwinden kann, wie z. B. eingeschränkte Spenderquellen, Morbidität an der Spenderstelle und Krankheitsübertragung. Die Anwendung von durch Gewebezüchtung hergestellten Knochentransplantaten umfasst die folgenden Schritte: (i) Zellisolierung und -expansion, (ii) Wachstum von Zellen auf der Oberfläche des Gerüsts, (iii) In-vitro-Kultur von mit Zellen besätem Biomaterial, um ein lebendes Knochentransplantat zu erzeugen und (iiii) Implantation des hergestellten Transplantats in die Verletzungsstelle1,2. Um das lebende Knochentransplantat in vitro erfolgreich herzustellen, ist es von entscheidender Bedeutung, die Mikroumgebung in vivo nachzuahmen, indem Osteoprogenitorzellen/mesenchymale Stammzellen geeigneten Reizen/Faktoren ausgesetzt werden. Es ist bekannt, dass die herkömmliche statische Kulturmethode dreidimensionaler (3D) Konstrukte nicht gut genug ist, um geeignete Bedingungen (z. B. ausreichender Transport von Nährstoffen zu den Zellen) bereitzustellen, um Knochengewebe zu erhalten, das dem in vivo vorkommenden ähnelt. Daher können Bioreaktorsysteme verwendet werden, um die Robustheit und Effizienz der Knochentransplantaterzeugung zu verbessern, indem entscheidende Parameter während der Zellkultur kontrolliert werden und eine homogene Zellverteilung, ausreichende Gas- und Nährstoffkonzentrationen, Abfallentfernung und mechanische Kräfte bereitgestellt werden3,4. Es gibt verschiedene Arten von Bioreaktorsystemen, z. B. Perfusionsbioreaktoren, rotierende Bioreaktoren, Spinner-Flaschen-Bioreaktoren, die geeignete Bedingungen für die Knochentransplantaterzeugung in vitro bieten können.

Perfusionsbioreaktoren verwenden ein Pumpensystem, das das Kulturmedium kontinuierlich perfundiert und so für einen angemessenen Massentransport von Nährstoffen und Gasen sowie kontrollierte mechanische Reize sorgt5. Perfusionssysteme bestehen im Allgemeinen aus einer Pumpe, einem Kulturmediumreservoir, einem Schlauchkreislauf, Gefäßen, die die Gerüste halten, und einem Abfallgefäß3,4. Der wichtige Parameter in diesen Systemen ist die Durchflussrate des Mediums, die Wandschubspannungen induzieren kann, die sich auf die Mikroumgebung der Zellen auswirken und dadurch den Prozess der Knochenbildung unterstützen2,4. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Zellkultur in den Perfusionsbioreaktoren die osteogene Differenzierung von Osteoprogenitorzellen/mesenchymalen Stammzellen im Vergleich zur statischen Kultur verbesserte, indem sie die Expression osteogenesebezogener Gene (z. B. Osteopontin (OPN), alkalische Knochenphosphatase (bALP), Osteocalcin) erhöhte (OC), Kollagen Typ I (Col I))6,7,8. Dynamische Bioreaktoren (z. B. rotierende Bioreaktoren, Spinner-Flaschen-Bioreaktoren) wiederum wurden in erster Linie entwickelt, um Nährstoffe und Sauerstoff auf homogene Weise bereitzustellen und eine Umgebung mit geringer Scherung zu schaffen, die eine wichtige Rolle bei der Verbesserung der Osteogenese durch Aktivierung von Mechanotransduktions-Signalwegen spielt6,9. Das von der National Aeronautics and Space Administration (NASA) entwickelte Rotary Cell Culture System (RCCS) simuliert relative Mikrogravitationsbedingungen und sorgt so für eine Umgebung mit geringer Scherung und optimalen Stofftransfer9. Das gebräuchlichste RCCS besteht aus einer Drehbasis mit Steuerung der Drehgeschwindigkeit und einem horizontal rotierenden Gefäß. Die mit Zellen besiedelten Biomaterialien können entweder im freien Fall gehalten oder an einer Nadel im rotierenden Gefäß fixiert werden. Darüber hinaus kann dieser Bioreaktortyp auch ohne Biomaterialien verwendet werden, um in vivo 3D-Zellaggregate zu erzeugen, die Gewebe ähneln2. Ähnlich wie bei Perfusionsbioreaktoren haben einige Studien gezeigt, dass die rotationsbasierte Kultivierungsmethode die Expression osteogenesebezogener Gene (z. B. bALP, OC, Col I) und die Mineralisierung der extrazellulären Matrix (ECM) in mesenchymalen Stammzellen im Vergleich zur statischen Kultur erhöhte10. 11,12.

Ein weiterer entscheidender Aspekt, der bei der Herstellung des lebenden Knochentransplantats in vitro berücksichtigt werden sollte, ist die Auswahl eines geeigneten Gerüstmaterials, das als Plattform für die Expansion knochenbildender Zellen dient. Wichtig ist, dass die 3D-Zellkultur auf der Oberfläche des Gerüsts Bedingungen bietet, die teilweise die Mikroumgebung in vivo nachahmen, da sie eine geeignete Zell-Zell-Übertragung, ein interzelluläres Signalnetzwerk und Wechselwirkungen zwischen Zell-extrazellulären Matrixkomponenten ermöglicht13. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, dass das für die Erzeugung lebender Knochentransplantate verwendete Biomaterial eine hohe Biokompatibilität, Osteokonduktivität und idealerweise Osteoinduktivität aufweist. Ein Gerüst, das alle genannten Eigenschaften besitzt, unterstützt die Zelladhäsion, Migration, Proliferation und osteogene Differenzierung. Darüber hinaus sollten Knochengerüste für HdO-Anwendungen eine makroporöse Mikrostruktur mit miteinander verbundenen Porennetzwerken besitzen, um das Einwachsen von Zellen zu erleichtern und Raum für die Bildung neuer Blutgefäße nach der Implantation zu schaffen. Die hohe Makroporosität des Biomaterials gewährleistet außerdem eine gleichmäßige Diffusion von Nährstoffen, Metaboliten und Gasen innerhalb des Implantats. Ein weiteres wichtiges Merkmal des Knochengerüsts ist seine langsame biologische Abbaubarkeit, die die natürliche Knochenbildung und den Knochenumbau in vivo unterstützt2,3,14,15. Es wird außerdem empfohlen, dass die Produktionsmethode für Gerüstbiomaterial kosteneffektiv ist15.

Die Entwicklung einer kostengünstigen und effizienten Methode zur Herstellung von Knochentransplantaten in vitro für klinische Anwendungen ist eine große Herausforderung für BTE. Es gibt eine Reihe von im Handel erhältlichen künstlichen, aus Gewebe hergestellten Knochen-Allotransplantaten, z. B. INFUSE® (Medtronic Spinal and Biologics, Memphis, TN, USA), Osteocel® Plus, Osteocel® PRO (Nuvasive, San Diego, CA, USA), CeLLogix (Omnia). Medical, Morgantown, WV, USA), Trinity ELITE® (Orthofix Medical Inc., Lewisville, TX, USA)16. Allerdings sind die Produktionskosten der meisten von ihnen hoch, was dazu führt, dass der Wert des Marktes für Knochentransplantate und -ersatz (einschließlich Allotransplantate, Knochentransplantatersatzstoffe und zellbasierte Matrizen) im Jahr 2021 auf 2586,30 Millionen US-Dollar geschätzt wird und voraussichtlich 4005,26 US-Dollar erreichen wird Millionen bis 203117. Der verfügbaren Literatur zufolge haben viele Studien über eine biologische Bewertung von biotechnologisch hergestellten Knochengewebekonstrukten nach der Kultivierung in einem Typ von Bioreaktorsystem berichtet6,7,8,10,11,12. Da die Wirksamkeit der Bildung von Knochenkonstrukten in vitro jedoch stark von den Kulturbedingungen abhängt, ist es gerechtfertigt, verschiedene Bioreaktorsysteme zu vergleichen, die am häufigsten für BTE-Zwecke verwendet werden.

Ziel dieser Studie war es daher, die Wirksamkeit von Perfusions- und rotierenden Bioreaktorsystemen bei der Erzeugung des lebenden Knochentransplantats in vitro zu vergleichen. In der Forschung wurden das Lazar Arrow-MTM Micro Bioreactor System (Lazar Research Laboratories, Inc., Los Angeles, CA, USA) und das Rotary Cell Culture System (RCCS, Synthecon, Houston, TX, USA) als Modellperfusions- und Rotationssystem verwendet , jeweils. Es gibt eine große Vielfalt an dynamischen 3D-Bioreaktoren für HdO-Anwendungen. Die verschiedenen Bioreaktorsysteme unterscheiden sich jedoch hinsichtlich Kosteneffizienz, Benutzerfreundlichkeit, Überwachungsoptionen, Produktivität, Produktionsumfang und empfohlenen Anwendungen. Das Lazar Arrow-MTM Mikrobioreaktorsystem gehört zu den einfach zu bedienenden Perfusionsbioreaktoren mit kontinuierlichem Mediumfluss in einem offenen Kreislaufsystem und mit indirekter Perfusion (das Medium fließt um das mit Zellen besiedelte Biomaterial herum). Das RCCS wiederum ist eine einzigartige 3D-Zellkulturtechnologie mit der Fähigkeit, relative Mikrogravitationsbedingungen zu stimulieren. Es wird häufig zur Erstellung von 3D-Zell- und Gewebemodellen für verschiedene Anwendungen verwendet. Die für die Zwecke dieser Studie ausgewählten Bioreaktoren sind einfach zu bedienende und kostengünstige Geräte, die für den Betrieb im Labormaßstab konzipiert sind. Dennoch ist im Gegensatz zu typischen Bioreaktoren im industriellen Maßstab die Kontrolle wichtiger Kultivierungsparameter wie pH-Wert, Gas- und Nährstoffkonzentration im Medium sowie Scherbeanspruchung aufgrund der Einfachheit dieser Geräte unmöglich. Andererseits sind Bioreaktoren, die in der Industrie für biopharmazeutische, Lebensmittel-, Landwirtschafts- und biotechnologische Anwendungen eingesetzt werden, zwar in der Lage, entscheidende Bedingungen für die Produktion in großem Maßstab zu kontrollieren, sie sind jedoch sehr spezialisierte und technologisch fortschrittliche Geräte, die hohe Kosten des Produktionsprozesses verursachen . Dennoch wurden in dieser Studie konstante Zellkulturbedingungen sichergestellt, indem sowohl Bioreaktoren (Perfusion und Rotation) als auch statische Kultur (in einer Multiwell-Platte) in einem Inkubator mit 37 °C und einer feuchten Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % CO2 platziert wurden. Daher wurden alle getesteten Gruppen den gleichen Umgebungsbedingungen ausgesetzt (dh Temperatur, Luftfeuchtigkeit, CO2-Konzentration und Umweltstörungen durch Öffnen/Schließen der Bioreaktortür). Um die Wirksamkeit ausgewählter Perfusions- und rotierender Bioreaktorsysteme bei der Erzeugung von lebendem Knochentransplantat, aus Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (BMDSCs) und zuvor entwickelten Knochengerüsten auf Hydroxylapatitbasis mit nachgewiesener hoher Biokompatibilität, Osteokonduktivität und Osteoinduktivität zu vergleichen18,19, 20, wurden verwendet. Das für diese Vergleichsstudien ausgewählte Modellbiomaterial besteht aus Nanopulver aus Hydroxylapatit und einer Chitosan/Agarose-Matrix. Wichtig ist, dass sich das Biomaterial durch hohe Bioaktivität (Fähigkeit zur Bildung von Apatitkristallen auf seiner Oberfläche), biologische Abbaubarkeit, raue Mikrostruktur, hohe offene (70 %) und vernetzte Makroporosität sowie eine mit Spongiosa vergleichbare Druckfestigkeit auszeichnet und ein geringes Risiko einer Entzündungsreaktion birgt18 ,19,20, was darauf hinweist, dass es sich um eine gute Plattform für die Expansion knochenbildender Zellen während der Erzeugung eines lebenden Knochentransplantats in vitro handelt. Die Verwendung des Knochengerüsts mit allen oben genannten Merkmalen gewährleistete eine gute Haftung und Proliferation von BMDSCs und war ein Garant für den Erfolg dieser Vergleichsstudien. Darüber hinaus wurde in dieser Studie eine 3D-Kultur von BMDSCs unter statischen Bedingungen durchgeführt, die als Testkontrolle diente. Zellproliferation, -differenzierung und -mineralisierung wurden mit ausgewählten 3D-Kulturbedingungen verglichen, die die günstigste Mikroumgebung für die Zellkultivierung bieten und die Bildung des Knochenkonstrukts auf die effizienteste Weise unterstützen.

Hochmakroporöse Biomaterialien, die als Plattform für das Zellwachstum dienen, wurden gemäß dem im polnischen Patent Nr. 235822 und mit der zuvor beschriebenen Methode19,21. Kurz gesagt: 2 % (w/v) Chitosan (50–190 kDa MW, Sigma-Aldrich Chemicals, Warschau, Polen), 5 % (w/v) Agarose (Gelpunkt 36 ± 1,5 °C, Sigma-Aldrich Chemicals, Warschau). , Polen) und 40 % (w/v) Hydroxylapatit-Nanopulver (Partikelgröße < 200 nm, Sigma-Aldrich Chemicals, Warschau, Polen) wurden in Essigsäurelösung (Avantor Performance Materials, Gliwice, Polen) suspendiert und gemischt. Anschließend wurde Natriumbicarbonat (Sigma-Aldrich Chemicals, Warschau, Polen) zugegeben. Die erhaltene Paste wurde in zylinderförmige Formen überführt und erhitzt (95 °C), abgekühlt, eingefroren und anschließend gefriergetrocknet. Abschließend wurden die resultierenden Biomaterialien in Natriumhydroxidlösung (Avantor Performance Materials, Gliwice, Polen) getaucht, mit entionisiertem Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Mikrostruktur des hergestellten Gerüsts wurde mit einem Stereomikroskop (Olympus SZ61TR, Olympus Polska Sp. z oo, Warschau, Polen) sichtbar gemacht (Abb. 1). Vor Zellkulturexperimenten wurden die Gerüste mit Ethylenoxid sterilisiert.

Mikrostruktur des hergestellten Gerüsts, sichtbar gemacht durch ein Stereomikroskop.

Die Studie wurde unter Verwendung von aus menschlichem Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen (BMDSCs) durchgeführt, die von der American Type Culture Collection Cell Bank (ATCC-LGC Standards, Teddington, UK) erworben wurden. BMDSCs wurden in einem Mesenchymal Stem Cell Basal Medium (ATCC-LGC Standards, Teddington, UK) kultiviert, das mit den Komponenten des Bone Marrow-Mesenchymal Stem Cell Growth Kit (ATCC-LGC Standards, Teddington, UK) und Antibiotika (10 U/ml) ergänzt war Penicillin und 10 µg/ml). Die Zellen wurden bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO2 gehalten.

BMDSCs (Passage 2) wurden direkt auf die Oberfläche von Biomaterialien (8 mm Durchmesser und 3 mm Dicke) gesät, die in den Vertiefungen der 48-Multiwell-Platte in 500 µL vollständigem Kulturmedium mit einer Dichte von 1 × 105 Zellen/ml platziert wurden . Vor dem Einbringen der Biomaterialien in Bioreaktoren (24 Stunden nach der Aussaat) wurde die Lebensfähigkeit der Zellen auf den Gerüsten mit einem Live/Dead Double Staining Kit (Sigma-Aldrich Chemicals, Warschau, Polen) gemäß der Methode des Herstellers überprüft. Die gefärbten Zellen wurden unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (CLSM, Olympus Fluoview mit FV1000, Olympus Polska Sp. z oo, Warschau, Polen) beobachtet. Als nächstes wurde ein Teil der mit Zellen besiedelten Biomaterialien in den Vertiefungen der 48-Multiwell-Platte belassen und als statische 3D-Kultur behandelt (Proben mit der Markierung mat_S), während der verbleibende Teil der mit Zellen besäten Biomaterialien in den Perfusionsbioreaktor gegeben wurde (Lazar Arrow-MTM Micro Bioreactor System, Lazar Research Laboratories, Inc., Los Angeles, CA, USA) (Proben mit mat_P gekennzeichnet) und im rotierenden Bioreaktor (Rotary Cell Culture System (RCCS), Synthecon, Houston, TX, USA). ) (Proben mit der Markierung mat_R) mit einer kontinuierlichen Rotationsrate von 1 U/min. Abbildung 2 zeigt den repräsentativen Aufbau statischer und dynamischer 3D-Kulturen. 3D-Zellkulturen unter statischen Bedingungen und im Perfusionsbioreaktor wurden in den unabhängigen Vertiefungen der Platte gehalten. Im Fall des rotierenden Bioreaktors wurden mit Zellen besiedelte Biomaterialien auf den Nadeln fixiert und im selben rotierenden Gefäß kultiviert. Der Aufbau statischer und dynamischer 3D-Zellkulturen wurde dreimal als drei unabhängige Experimente durchgeführt.

Aufbau von 3D-BMDSC-Kulturen unter statischen Bedingungen, im Perfusionsbioreaktor (Lazar Arrow-MTM Micro Bioreactor System) und im rotierenden Bioreaktor (Rotary Cell Culture System (RCCS), Synthecon). Rote Pfeile zeigen die Platzierung der mit Zellen ausgesäten Biomaterialien an.

Um die osteogene Differenzierung von BMDSCs zu induzieren, wurden Zellen im osteogenen Medium kultiviert, das aus vollständigem Kulturmedium, ergänzt mit 10 mM β-Glycerophosphat, 50 µg/ml Ascorbinsäure und 10–7 M Dexamethason (Sigma-Aldrich Chemicals, Warschau, Polen) bestand. . Das osteogene Medium wurde den Zellen nach 24-stündiger Kultur auf der Oberfläche der Biomaterialien in einem vollständigen Kulturmedium zugesetzt. Als nächstes wurden die statischen Zellkultur- und Bioreaktoraufbauten in den Inkubator überführt und in einer feuchten Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO2 bei 37 °C gehalten. Bei der statischen Zellkultur wurden die Zellen in 500 µL osteogenem Medium kultiviert und alle vier Tage wurde die Hälfte des Mediums durch eine frische Portion ersetzt. Im Perfusionsbioreaktor gehaltene BMDSCs wurden wiederum auf den Gerüsten kultiviert, die in den Vertiefungen einer 6-Multiwell-Platte in 5 ml osteogenem Medium mit einer Perfusionsgeschwindigkeit (mittlere Flussrate) von 20 µL/min platziert waren. Im rotierenden Bioreaktor wurden mit Zellen besiedelte Biomaterialien auf einer Nadel fixiert, die mit einem Boden des rotierenden Gefäßes verbunden ist, das 50 ml des osteogenen Mediums enthält. Jeden vierten Tag wurden 10 ml des Mediums durch eine frische Portion ersetzt. Nach 21 Tagen statischer und dynamischer 3D-Kulturen wurden die Biomaterialien verschiedenen Analysen unterzogen, die in den folgenden Unterabschnitten beschrieben werden.

Die Bewertung des Zellwachstums und der Morphologie auf der Oberfläche von Biomaterialien 24 Stunden nach der Aussaat und nach Langzeitkultur (21 Tage) unter statischen und dynamischen Bedingungen erfolgte durch Färbung des Zytoskeletts und der Zellkerne mit AlexaFluor635-konjugiertem Phallotoxin bzw. DAPI. Die Zellen wurden mit Paraformaldehyd fixiert, mit Triton DAPI (Sigma-Aldrich Chemicals, Warschau, Polen) gemäß der zuvor beschriebenen Methode22. Die gefärbten Zellen wurden mit dem CLSM beobachtet und die erhaltenen Bilder wurden mit der ImageJ-Softwareversion 1.52a analysiert, um Zellkerne zu zählen. Darüber hinaus wurde die Visualisierung zellbesiedelter Biomaterialien auch mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM, JEOL JCM-6000Plus, Japan) durchgeführt. Zur SEM-Visualisierung wurden die Proben durch Fixierung mit Paraformaldehyd und Dehydratisierung in abgestuftem Ethanol vorbereitet. Anschließend wurden die dehydrierten Proben mit einer dünnen Goldschicht besputtert. Das detaillierte Protokoll zur Probenvorbereitung wurde bereits zuvor beschrieben23.

Die Zellproliferation wurde durch Messung des Gehalts an gesamter zytoplasmatischer Lactatdehydrogenase (LDH) nach Zelllyse unter Verwendung des Lactate Dehydrogenase Activity Assay Kit (Sigma-Aldrich Chemicals, Warschau, Polen) bewertet. Um den Anstieg der Zellzahl mit der Zeit zu bestimmen, wurde der Test in zwei Zeitintervallen durchgeführt: (1) 24 Stunden nach der Zellaussaat und (2) nach 21 Tagen Kultur. Der Test wurde nach dem Verfahren des Herstellers durchgeführt. Gemäß dem Protokoll ist der nach der Zelllyse nachgewiesene Gesamt-LDH-Gehalt proportional zur Anzahl der Zellen in einer Population. Je höher die OD-Werte bei 490 nm mit der Referenzwellenlänge von 690 nm waren, desto mehr BMDSCs waren auf den Biomaterialien vorhanden.

Um den osteogenen Differenzierungsprozess von BMDSCs zu bewerten, wurden osteogene Marker (Kollagen Typ I (Col I), Osteopontin (OPN), Knochensialoprotein 2 (BSP2), Osteocalcin (OC)) in Zelllysaten unter Verwendung geeigneter enzymgebundener Immunosorbens-Assays bestimmt ( ELISAs) (EIAab ELISAs Kit, Wuhan, China). Die Zelllysate wurden durch zwei Gefrier-Tau-Zyklen und einen Ultraschallprozess (Ultraschallprozessor UO100H Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Deutschland) für 30 s bei 30 % Amplitude gewonnen. Der Gehalt an osteogenen Markern wurde auf den gesamten zellulären Proteingehalt normalisiert, der für jede Probe mithilfe eines BCA-Protein-Assay-Kits (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) geschätzt wurde. Die ELISA-Ergebnisse wurden sowohl als ng osteogener Marker pro ml (als ursprüngliche ELISA-Ergebnisse bezeichnet) als auch als ng osteogener Marker pro mg gesamter zellulärer Proteine ​​(normalisierte ELISA-Daten) ausgedrückt. Die osteogene Differenzierung wurde auch durch Immunfluoreszenzfärbung (IF) osteogener Marker (Col I und Osteonectin (ON)) bestimmt. Proben für die IF-Färbung wurden gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren22 vorbereitet.

Die Raman-Spektroskopie der Proben wurde mit einem DXR-Raman-Mikroskop (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) durchgeführt. Das Gerät war mit einem Laser mit einer Anregungswelle von 780 nm und einer Ausgangsleistung von 15 mW ausgestattet. Um die beste Raman-Intensität der aufgezeichneten Spektren zu erhalten, wurden die Messparameter im Spektralbereich von 900–1000 cm−1 mit 10 × Objektiv und CCD-Kamera optimiert. Es wurde eine 50-Loch-Blende verwendet. Für die Spektrenanalyse wurden 30 Messungen mit spezieller Software aufgezeichnet (Omnic Version 8.2.0.387, Thermo Fisher Scientific, Madison, WI, USA). Spektralanalyse, Hauptkomponentenanalyse (PCA) und Hyperspektralanalyse wurden mit der Orange Hyperspectral Data Processing Suite mit der Quasar-Software (Version 1.5.0) durchgeführt. Die gewählten Vorverarbeitungsschritte waren die Auswahl des Spektralbereichs für 200–2000 cm−1, die Savitzky-Golay-Glättung unter Verwendung des 2-Punkte-Algorithmus und die Normalisierung auf das 960 cm−1-Band.

Zur Visualisierung der räumlichen Knochenreifung wurden unterschiedliche Verhältnisse von Raman-Peaks verwendet. Die Farbe zeigt für jedes Pixel das Verhältnis dieser beiden Peaks an diesem Pixel mit einer Heatmap-Skala mit festen Min-Max-Werten zwischen den Gruppen. Zur Durchführung dieser Analysen wurde die CytoSpec-Software (Version 2.00.01, Berlin, Deutschland) verwendet.

Die Experimente wurden mindestens dreifach durchgeführt (n ≥ 3). Die erhaltenen Daten wurden als Mittelwerte ± SD angezeigt. Statistisch signifikante Ergebnisse zwischen den Proben wurden bei P < 0,05 unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Tukey-Test (GraphPad Prism 8.0.0 Software) berücksichtigt.

Abbildung 3 zeigt die Bewertung der Lebensfähigkeit, Adhäsion, Morphologie und Anzahl der Zellen vor und nach 21 Tagen Kultur unter statischen und dynamischen Bedingungen. Vor dem Einbringen von mit Zellen ausgesäten Biomaterialien in die Bioreaktoren wurden die Lebensfähigkeit und Morphologie der Zellen durch Anfärben lebender/toter bzw. F-Actin-Filamente bestimmt (Abb. 3a). Bilder des konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (CLSM) zeigten 24 Stunden nach der Aussaat eine große Anzahl lebensfähiger Zellen (grüne Fluoreszenz) auf den Oberflächen der Knochengerüste. Darüber hinaus zeigte die Färbung der F-Actin-Filamente, dass BMDSCs gut verteilt waren und eine abgeflachte Morphologie aufwiesen, was auf ihre gute Haftung und ihr gutes Wachstum auf der Oberfläche von Biomaterialien hinweist. Nach 21 Tagen Kultivierung zeigten CLSM-Bilder, dass auf der Oberfläche von Biomaterialien im rotierenden Bioreaktor (mat_R) kultivierte Zellen eine vollständige Konfluenz erreichten, wohingegen im Perfusionsbioreaktor (mat_P) gehaltene Zellen eine vollständige Konfluenz erreichten. 70 % Zusammenfluss. BMDSCs wiederum zeigten nach der Kultur im statischen Zustand (mat_S) ca. 90 % Konfluenz (Abb. 3b). Somit belegen die erzielten Ergebnisse, dass die Oberfläche von Biomaterialien die Zellproliferation unabhängig von den angewandten Kulturbedingungen unterstützt. Diese Beobachtung wurde durch eine quantitative Auswertung der Zellzahl bestätigt, die durch einen Gesamt-LDH-Assay und eine Kernzählung mit der ImageJ-Software durchgeführt wurde. Die Analyse zeigte, dass die Anzahl der BMDSCs auf der Oberfläche von Biomaterialien nach der Kultivierung im Perfusionsbioreaktor (mat_P) im Vergleich zur statischen Kultur (mat_S) und der Kultur im rotierenden Bioreaktor (mat_R) signifikant niedriger war (P < 0,0001) (Abb. 3b,c).

Bewertung der Lebensfähigkeit, Morphologie und Proliferation von BMDSCs: (a) CLSM-Bilder von BMDSCs auf der Oberfläche von Knochengerüsten vor der Kultivierung in den Bioreaktoren (Live/Dead-Färbung: grüne Fluoreszenz zeigt lebensfähige Zellen an, rote Fluoreszenz zeigt tote Zellen an; F-Actin Filamente und DAPI-Färbung: rote Fluoreszenz zeigt Zytoskelettfilamente an, blaue Fluoreszenz zeigt Kerne an; Vergrößerung × 100); (b) CLSM-Bilder von BMDSCs auf der Oberfläche von Knochengerüsten nach 21-tägiger Kultur unter statischen und dynamischen Bedingungen (rote Fluoreszenz zeigt Zytoskelettfilamente an, blaue Fluoreszenz zeigt Kerne an; die Zellzahl wurde durch Kernzählung pro 1 cm2 Biomaterialoberfläche mit bewertet ImageJ-Softwareversion 1.52a; Vergrößerung × 100); (c) Zellproliferationsbewertung durch Gesamt-LDH-Assay (*statistisch signifikante Ergebnisse im Vergleich zu mat_S, #statistisch signifikante Ergebnisse im Vergleich zu mat_P, P < 0,05, einfache ANOVA gefolgt von Tukey-Test).

Die Färbung des Zellzytoskeletts (F-Actin-Filamente) nach 21-tägiger Kultur zeigte eine relativ gleichmäßige Zellverteilung auf der Oberfläche von Knochengerüsten, selbst nach der Kultur unter statischen Bedingungen (Abb. 3b). Die erhaltenen Ergebnisse stimmen mit der Rasterelektronenmikroskop-Aufnahme (REM) überein, die nach 21-tägiger Kultur unabhängig von den angewandten Bedingungen (statisch oder dynamisch) große Schichten von BMDSCs auf den Oberflächen von Biomaterialien zeigte (Abb. 4). Darüber hinaus wurde eine Zellinfiltration in die Poren der Biomaterialien beobachtet.

REM-Bilder, die BMDSCs auf der Oberfläche von Knochengerüsten nach 21-tägigen statischen und dynamischen 3D-Kulturen zeigen (rote Pfeile zeigen Zellschichten; Vergrößerung × 170 und × 340).

Die Menge an osteogenen Markern wurde durch ELISAs in BMDSCs nach 21-tägigen statischen und dynamischen 3D-Kulturen bestimmt. Abbildung 5a zeigt die ursprünglichen (rohen) ELISA-Ergebnisse (ausgedrückt als ng Marker pro ml), während Abbildung 5b normalisierte Daten pro mg der gesamten zellulären Proteine ​​zeigt. Die Normalisierung wurde durchgeführt, um zu überprüfen, ob eine verstärkte Proliferation und damit eine höhere Zellbiomasse der im rotierenden Bioreaktor gehaltenen Probe die Ergebnisse des osteogenen Differenzierungstests direkt beeinflussten. Interessanterweise blieb der Trend der erhaltenen Ergebnisse nach der Normalisierung unverändert, nämlich war das Niveau der osteogenen Marker für mat_R höher als für mat_P, unabhängig von der Darstellung der Ergebnisse (mit Normalisierung oder ursprünglichen ELISA-Daten). Es bestätigt, dass der rotierende Bioreaktor den osteogenen Differenzierungsprozess stärker unterstützte als der Perfusionsprozess. Nach der Normalisierung wurden jedoch weniger statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Proben beobachtet. Im Allgemeinen produzierten unter statischen Bedingungen (mat_S) kultivierte BMDSCs höhere Mengen an osteogenen Markern als die in beiden Bioreaktoren (mat_P und mat_R) gezüchteten Zellen (Abb. 5). Ursprüngliche ELISA-Ergebnisse zeigten, dass trotz einer ähnlichen Menge an Zellen, die nach 21 Tagen Kultur unter statischen Bedingungen und im rotierenden Bioreaktor auf den Oberflächen von Biomaterialien vorhanden waren, die Produktion osteogener Marker (Col I mit P < 0,05 und OC mit P < 0,05) war bei stationär kultivierten BMDSCs signifikant höher (Abb. 5a). Dennoch zeigten normalisierte ELISA-Daten keine statistisch signifikanten Unterschiede im Niveau der osteogenen Marker zwischen mat_S und mat_R (Abb. 5b). Unter Berücksichtigung der Ergebnisse ohne Normalisierung pro mg Gesamtprotein produzierten im rotierenden Bioreaktor (mat_R) kultivierte BMDSCs vergleichbare Mengen an Col I, BSP2 und OC wie die im Perfusionssystem gehaltenen Zellen (mat_P). Es wurde jedoch beobachtet, dass die 3D-Kultur im rotierenden Bioreaktor zu deutlich höheren Mengen an OPN führte (P < 0,01) (Abb. 5a). Darüber hinaus war der OPN-Wert für mat_R mit dem für mat_S vergleichbar. Nach der Normalisierung der Ergebnisse produzierten im rotierenden System gezüchtete Zellen immer noch eine größere Menge an OPN als im Perfusionsbioreaktor kultivierte BMDSCs, die erhaltenen Ergebnisse waren jedoch statistisch nicht signifikant (Abb. 5b). Dennoch ergab die Normalisierung eine deutlich größere Menge an Col I (P < 0,01) für die mat_R-Probe im Vergleich zu mat_P.

Die Menge an osteogenen Markern, bestimmt durch ELISAs in BMDSCs nach 21-tägigen statischen und dynamischen 3D-Kulturen. Die Ergebnisse wurden als (a) ng Marker pro ml (ursprüngliche ELISA-Daten) und als (b) ng Marker pro mg der gesamten zellulären Proteine ​​(normalisierte ELISA-Daten) ausgedrückt; *statistisch signifikante Ergebnisse im Vergleich zu mat_S, #statistisch signifikante Ergebnisse im Vergleich zu mat_P, P < 0,05, einfache ANOVA gefolgt von Tukey-Test.

CLSM-Bilder ausgewählter osteogener Marker, die mit der IF-Technik gefärbt wurden, zeigten keine merklichen Unterschiede in den Mengen an Col I und ON in der ECM von in den Bioreaktorsystemen kultivierten BMDSCs im Vergleich zu den statischen Bedingungen (Abb. 6).

CLSM-Bilder zeigen die Immunfluoreszenzfärbung von Typ-I-Kollagen und Osteonektin in der extrazellulären Matrix von BMDSCs nach 21-tägigen statischen und dynamischen 3D-Kulturen (rote Fluoreszenz weist auf Typ-I-Kollagen hin; grüne Fluoreszenz weist auf Osteonektin hin, blaue Fluoreszenz weist auf Kerne hin; Vergrößerung × 200).

Die resultierenden mittleren Spektren der untersuchten Proben sind in Abb. 7a dargestellt. Zum besseren Vergleich wurden die Spektren auf die höchste Bande bei 960 cm−1 normiert, die der ν1-Streckung der PO-Banden in den PO4-Gruppen von Hydroxylapatitkristallen zugeordnet wurde24. Die Spektren wiesen charakteristische Merkmale auf, die Hydroxylapatit zugeschrieben werden, mit Bandenmaxima bei 430, 590, 960, 1045 und 1074 cm−1, die Schwingungen der Phosphatgruppe entsprachen: ν2, ν4, ν1, ν3 bzw. (CO3)2−25. Das unbehandelte Biomaterial (nativ) war die Referenzprobe für mit Zellen besiedelte Biomaterialien, die unter statischen Bedingungen (mat_S), in Bioreaktoren (mat_P und mat_R) gehalten wurden, und für nicht besiedeltes Biomaterial, das im Kulturmedium inkubiert wurde (als Kontrolle markierte Probe). Die vollständigen Spektren von nativem, Kontroll- und mat_S schienen identisch zu sein. In den Spektren wurde keine Umwandlung in amorphes Calciumphosphat (ACP) beobachtet, da in den durchschnittlichen Spektren keine 960-Bandenverschiebung zu 950 cm-1 vorlag24. Allerdings zeigte die zweite Ableitung in mat_S (Abb. 7b) eine kleine Verschiebung von 960 auf 961 cm−1, die einer weniger kristallinen Form von Hydroxylapatit zugeordnet werden kann26. Es ist bemerkenswert, dass mat_R im Vergleich zu allen anderen Gruppen eine geringere Intensität im Bereich von 1200–1600 cm-1 aufwies, was den organischen Komponenten von biogenem Hydroxylapatit entspricht27.

Raman-Analyse von zellbesiedelten Biomaterialien nach 21-tägigen statischen und dynamischen 3D-Kulturen: (a) Raman-Mittelwertspektren für untersuchte Proben, normalisiert auf 960 cm−1; (b) zweite Ableitung der Raman-Spektren im Bereich 940–980 cm−1; (c) ein Ergebnisdiagramm der Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Kontroll- und untersuchten Proben mit einer Varianz von 83 % (nativ – unbehandeltes Biomaterial, Kontrolle – nicht ausgesätes Biomaterial, inkubiert im Kulturmedium).

Um die Varianz der untersuchten Materialien zu vergleichen, wurde eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) in Datensätzen von 400 Spektren/Gruppe durchgeführt. Das Streudiagramm von PC1 vs. PC2 ist in Abb. 7c dargestellt, berechnet für Raman-Spektren. Es ist ersichtlich, dass es eine Überlappung zwischen Kontroll- und nativen Proben gab und eine gute Trennung der Spektren in Richtung PC1 beobachtet wurde, was 83 % der Varianz ausmachte. Offensichtlich befanden sich mat_P und mat_R in unterschiedlichen Regionen des Score-Plots. Die resultierenden PCA-Daten stimmten mit den gemittelten Spektren überein und unterschieden sich im Bereich von 1012–1096 cm−1, der den ν3-Schwingungen einer Phosphatgruppe zugeordnet wurde.

Nach einer validierten Methode von Taylor et al. Das Peakflächenverhältnis von ν1 PO4/δ CH2 wurde als Raman-Mineral/Matrix-Verhältnis (MMR)28 angesehen. Die berechneten Ergebnisse der MMR und anderer Verhältnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die MMR unterschied sich nicht zwischen nativen (10,52174) und Kontrollproben (10,07191). In mat_S (8,783927) und mat_P (9,79339) wurde ein Rückgang der Mineralisierung beobachtet, in mat_R (14,53026) jedoch ein Anstieg. Der für mat_S und mat_P festgestellte Rückgang der MMR-Werte im Vergleich zu den nativen (unbehandelten) und Kontrollproben (nicht ausgesät, in Kulturmedium inkubiert) war höchstwahrscheinlich auf das Vorhandensein einer großen Anzahl von Zellen auf den Gerüsten zurückzuführen, die ECM produzierten Proteine. Während native und Kontrollbiomaterialien auf Hydroxylapatitbasis nicht von organischen Komponenten in Form von Zellen und ECM-Proteinen bedeckt waren, waren die MMR-Werte für diese Proben aufgrund des Vorhandenseins mineralischer Bestandteile auf der Oberfläche höher. Im Gegenzug wurde für mat_R ein höherer MMR-Wert im Vergleich zu den nativen Proben und den Kontrollproben berechnet, trotz des Vorhandenseins einer großen Anzahl von Zellen auf seiner Oberfläche (wie in Zellwachstums- und Proliferationstests nachgewiesen wurde, Abb. 3b, c und Abb. 4). ) ist ein starker Beweis für eine verstärkte Mineralisierung der 3D-Kultur im rotierenden Bioreaktor. Eine weitere spektrale Auswertung des Hydroxylapatits erfolgte anhand der Bandenintensitätsverhältnisse in Bezug auf die Hauptphosphatgitter. Es wurden 430 und 590 bis 960 cm−1 untersucht, die Ergebnisse ähnelten jedoch denen der Kontrollen und denen aus Bioreaktoren. Allerdings unterschieden sich die Ergebnisse der Intensität der CO3-B-Substitution von ν3 zu ν1 und ν1 deutlich zwischen den Proben. Die Carbonatsubstitution (CO32−) ist einer der wichtigen Prozesse im Knochenmineral- und Knochenstoffwechsel, abhängig vom Alter des Einzelnen29. Typ B hängt mit natürlichen Knochen in der Frühphase zusammen, während Typ A häufiger bei älteren Knochen vorkommt30. Es wurde berichtet, dass typische Banden für Typ B zwischen 1065–1075 cm–1 und für Typ A im Bereich31 1095–1103 cm–1 schwanken. Eine verbesserte biologische Leistung des CO32−-substituierten Hydroxylapatits kann dazu führen, dass Knochentransplantate nach der Implantation anfälliger für eine Umgestaltung sind32. Um die Unterschiede zwischen den Proben zu beurteilen, wurden Verhältnisse ausgewählter Banden verwendet.

Die Reifung des Minerals in Proben wurde mit der Verhältnisverteilung verglichen, die durch Intensitätsänderungen in den Phosphat- (1077 und 960 cm-1) und Carbonat-Banden (1070 cm-1) angezeigt wurde, und ist in Abb. 8 mit festen Bereichen zum besseren Vergleich dargestellt Proben33. Die Verteilung von Phosphat zu B-Typ-Carbonat (I1077:I1070) war in allen untersuchten Gruppen gleichmäßig verteilt. Interessanterweise zeigte die Gesamtmenge von Hydroxylapatit zu B-Typ-Carbonat (I960:I1070) eine erhöhte Substitution in mat_R und eine leichte in mat_P, was eine neu gebildete knochenähnliche Struktur offenbarte31,33.

Raman-Verteilungsbilder des ν1 PO34−-Peaks (960 cm−1), des Verhältnisses von Phosphat-HA/karbonisiertem HA (960/1070 cm-1) und des Verhältnisses von Gesamt-HA/karbonisiertem HA (1077/1070 cm-1) (nativ – unbehandelt). Biomaterial, Kontrolle – nicht ausgesätes Biomaterial, inkubiert im Kulturmedium).

Die Hauptaufgabe des Skeletts besteht darin, die Körperlasten zu tragen, daher ist es ständiger mechanischer Stimulation ausgesetzt. Dynamische Knochenbelastung und auftretende mechanische Reize sind wichtige Faktoren im Knochenregenerationsprozess in vivo34. Bei BTE sind Bioreaktoren sehr wertvolle dynamische Systeme zur Nachahmung der Mikroumgebung von natürlichem Knochen unter In-vitro-Bedingungen, da sie durch die Gewährleistung mechanischer Reize geeignete Parameter während der Zellkultur steuern und bereitstellen können. Darüber hinaus sind Bioreaktorsysteme entscheidende Werkzeuge zur Erzeugung von Knochengewebekonstrukten ex vivo durch Kultivierung autologer knochenbildender Zellen auf der Oberfläche poröser 3D-Biomaterialien3. In dieser Studie wurden BMDSCs auf der Oberfläche zuvor entwickelter Gerüste auf Hydroxylapatitbasis mit mikrostrukturellen und mechanischen Eigenschaften kultiviert, die mit denen von Spongiosa vergleichbar sind19. Es wurden drei verschiedene Bedingungen angewendet: (1) statische 3D-Zellkultur (mat_S), (2) 3D-Kultur im Perfusionsbioreaktor mit einer Flussrate von 20 μL/min (mat_P) und (3) im rotierenden Bioreaktor mit einer Rotationsrate von 1 U/min (mat_R). Dieser Ansatz ermöglichte die Auswahl der effektivsten 3D-Kulturbedingungen zur Erzeugung des lebenden Knochentransplantats in vitro.

Im Rahmen dieser Studien wurde gezeigt, dass die Kultur mesenchymaler Stammzellen im rotierenden Bioreaktor im Vergleich zum Perfusionssystem zu einer deutlich größeren Proliferation (P < 0,0001) führte (Abb. 3b, c). Dies ist ein wichtiges Thema, da die entsprechende Zellzahl entscheidend ist, um eine ausreichende Zellbiomasse für die osteogene Differenzierung und den Knochenbildungsprozess sicherzustellen35. Die erhaltenen Ergebnisse stimmen mit den Studien von Yamada et al.8 überein, die berichteten, dass während der direkten Perfusion (1,6 ml/min Flussrate) die Proliferation von Ratten-BMDSCs auf Gerüsten auf Polyesterbasis signifikant gehemmt wurde. In ähnlicher Weise haben Salifu et al.6 nachgewiesen, dass menschliche fetale Osteoblasten (hFOB 1.19-Zelllinie), die auf der Oberfläche des Polycaprolacton/Hydroxylapatit-Gerüsts im Perfusionssystem (direkte Perfusion mit einer Flussrate von 1,6 ml/min) kultiviert wurden, eine verringerte Proliferation zeigten. Interessanterweise zeigten Mitra et al.36, dass die indirekte Perfusionskultur (Medienvolumen im Bioreaktor betrug 12 ml; Flussrate 3 ml/min) von BMDSCs, die auf einem Hydroxylapatit/Poly(lactid-co-glycolid)-Gerüst ausgesät waren, die Zellzahl erhöhte. Es ist zu beachten, dass die beobachtete Divergenz der Berichte in der verfügbaren Literatur bezüglich der Auswirkung der Kultivierung in Perfusionsbioreaktoren auf die Zellproliferation auf die verschiedenen Flussraten, Kulturkammern, die Art der Perfusion (direkt oder indirekt), die Herkunft der Stammzellen usw. zurückzuführen sein kann. Volumen und Art des verwendeten Kulturmediums und der verwendeten Gerüste. In dieser Studie war die angewandte Flussrate im Perfusionsbioreaktor im Vergleich zu den in der Literatur beschriebenen Systemen sehr niedrig (20 μl/min) (von 0,1 ml/min bis sogar 10 ml/min)7,8,37,38. Darüber hinaus wurden die Zellen in einem kleinen Volumen des Mediums (5 ml) in einem System mit offenem Kreislauf kultiviert, während andere Autoren entweder direkte Perfusion oder ein höheres Volumen des Kulturmediums oder ein System mit geschlossenem Kreislauf verwendeten. Das in diesem Forschungsvolumen verwendete Kulturmedium und die Durchflussrate wurden im Rahmen von Pilotstudien experimentell ausgewählt, um die höchste Lebensfähigkeit und Wachstumsrate der Zellen zu gewährleisten. Auch die Art des für die Zellkultivierung verwendeten Gerüsts hat großen Einfluss auf die Endergebnisse. Zum Beispiel Yamada et al. verwendeten mikroporöses Gerüst8, wohingegen in dieser Studie ein Gerüst mit hoher Makroporosität verwendet wurde. Insbesondere wurde beobachtet, dass BMDSCs die Fähigkeit hatten, in das miteinander verbundene Porennetzwerk der Gerüste hineinzuwachsen, was ein wichtiges Phänomen für die Erzeugung von Knochengewebekonstrukten in vitro ist, da es die natürliche Knochenbildung erleichtert3. Alle genannten Unterschiede im Versuchsaufbau erschweren den Vergleich der erzielten Ergebnisse mit den Berichten anderer Autoren.

BMDSCs gelten aufgrund ihrer guten osteogenen Differenzierungskapazität als eine der am besten geeigneten Zellquellen für BTE39. Das Standardverfahren zur Induktion der osteogenen Differenzierung mesenchymaler Stammzellen in vitro ist die Zellkultur in Gegenwart von Dexamethason (einem synthetischen Glukokortikoid), Ascorbinsäure und β-Glycerophosphat40. Die osteogene Differenzierung ist ein mehrstufiger und komplexer Prozess, dessen jeder Schritt durch typische Marker gekennzeichnet ist: (1) Proliferationsphase, (2) ECM-Synthese und -Reifung und (3) ECM-Mineralisierung. Im ersten Schritt der osteogenen Differenzierung vermehren sich Zellen aktiv, um ausreichend Zellbiomasse für die osteogene Differenzierung und den Knochenbildungsprozess sicherzustellen und produzieren hauptsächlich Col I und Fibronektin. Im ersten Stadium weisen die Zellen außerdem eine geringe bALP-Aktivität, eine geringe bis mäßige OPN-Produktion auf und exprimieren den Runt-bezogenen Transkriptionsfaktor 2 (RUNX2). Als nächstes kommt es zu einer verringerten Proliferationsrate und die Zellen beginnen, eine hohe bALP-Aktivität zu exprimieren, die während des ECM-Mineralisierungsprozesses Phosphate liefert. Im letzten Stadium wird eine hohe Expression von OC, OPN, ON und BSPs beobachtet, gefolgt von einer Kalzium- und Phosphatablagerung (ECM-Mineralisierungsphase)41,42,43.

In dieser Studie wurde die Menge typischer osteogener Marker (Col I, OPN, BSP2 und OC), die von auf der Oberfläche der Biomaterialien unter statischen und dynamischen Bedingungen gewachsenen BMDSCs produziert wurden, nach 21-tägiger Kultur durch ELISAs bewertet (Abb. 5). . Es wurde beobachtet, dass unter statischen Bedingungen (mat_S) kultivierte Zellen im Vergleich zu den in Bioreaktoren (mat_P und mat_R) kultivierten Zellen höhere Mengen an osteogenen Markern produzierten. Interessanterweise stimmen die erzielten Ergebnisse dieser Studie nicht mit den Berichten in der verfügbaren Literatur über den Anstieg der Produktion osteogener Marker durch mesenchymale Stammzellen nach der Kultivierung in Bioreaktoren überein6,7,8,10,11. Es wurde angenommen, dass eine höhere Produktion osteogener Marker in 3D-Kulturen, die unter statischen Bedingungen gehalten wurden, auf ein kleines Volumen (500 µL) des Kulturmediums zurückzuführen war, das konzentriertere Wachstumsfaktoren und Zytokine (autokrine und parakrine Signale) enthielt, die für die Förderung der osteogenen Differenzierung verantwortlich sind . Im Gegensatz dazu wurde mat_P in 5 ml osteogenem Medium mit einer mittleren Flussrate von 20 µL/min kultiviert, während mat_R in 50 ml osteogenem Medium kultiviert wurde. Die Häufigkeit der Mediumerneuerung könnte auch die osteogene Differenzierung beeinflusst haben. Im Fall von mat_S und mat_R erfolgte die Mediumerneuerung alle vier Tage, was ausreichte, um dank ihrer Kultur auf 3D- und hochporösen Proben eine hohe Lebensfähigkeit der BMDSCs aufrechtzuerhalten (die Verzögerungsphase, bekannt als Anpassungsphase, ist länger und die Proliferationsrate länger). langsamer auf 3D-Gerüsten im Vergleich zur 2D-Kultur). Es handelte sich um eine halbe Portion (250 µL) für mat_S und 10 ml (von 50 ml) für mat_R. Während der kontinuierliche Fluss des Mediums im Perfusionssystem zur Erneuerung von 28,8 ml des Mediums pro Tag führte, lag die Häufigkeit bei bis zu 5,76 Mal am Tag. Es ist bekannt, dass der Grad der osteogenen Differenzierung mesenchymaler Stammzellen in hohem Maße von der Ebene intrinsischer und extrinsischer Faktoren abhängt, einschließlich umgebender Zellen (parakrine Regulation) und von den Zellen selbst sezernierter Signale (autokrine Regulation)44. Somit erhöhte die Aufrechterhaltung der 3D-Kultur in einer kleinen Menge Kulturmedium die Konzentration entscheidender Moleküle, die für die Förderung der osteogenen Differenzierung in der umgebenden Mikroumgebung verantwortlich sind. Das Hauptziel dieser Studie bestand jedoch darin, die Wirksamkeit zweier häufig verwendeter Bioreaktorsysteme (Perfusionsbioreaktor – Lazar Arrow-MTM Micro Bioreactor System und rotierender Bioreaktor – RCCS, Synthecon) bei der Bildung des Knochentransplantats in vitro zu vergleichen, während 3D Die Kultur unter statischen Bedingungen diente nur als Testkontrolle. Eine vergleichende Bewertung dieser beiden Bioreaktorsysteme ergab, dass das rotierende System die osteogene Differenzierung stärker unterstützte als das Perfusionssystem, da es zu einer deutlich höheren (P < 0,01) OPN-Produktion (ursprüngliche ELISA-Daten) und (P < 0,05) Col I-Synthese führte ( normalisierte ELISA-Daten). Interessanterweise berichteten Gandhi et al.7, dass in Fibrinkügelchen eingekapselte und im Perfusionsbioreaktor mit einer Flussrate von 10 ml/min kultivierte BMDSCs von Ratten eine erhöhte Expression von OPN zeigten. Das OPN ist ein nicht-kollagenes Protein und ist für die Kalziumbindung und den ordnungsgemäßen Prozess der ECM-Mineralisierung verantwortlich41. Somit ist es ein wichtiger osteogener Marker bei der Bildung von neuem mineralisiertem Knochengewebe in vivo und ein vielversprechender Prädiktor bei der Knochentransplantatproduktion in vitro. Die osteogene Differenzierung von BMDSCs, die unter statischen und dynamischen Bedingungen kultiviert wurden, wurde auch durch Col I- und ON-Färbung unter Verwendung der IF-Technik bestimmt (Abb. 6). Col I ist das am häufigsten vorkommende kollagene Protein in der ECM von Knochen und spielt eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Knochenstärke. ON (auch bekannt als SPARC) ist ein später Marker der osteogenen Differenzierung (Mineralisierungsphase) und gehört zu den nicht-kollagenen Proteinen, die die Kalziumfreisetzung regulieren, indem sie Kollagen- und Hydroxylapatitkristalle binden und so die Kollagenmineralisierung während der Knochenbildung beeinflussen45. Wichtig ist, dass die durchgeführte IF-Färbung von ECM-Proteinen zeigte, dass BMDSCs, die sowohl unter statischen als auch dynamischen Bedingungen auf der Oberfläche von Hydroxylapatit-basierten Gerüsten kultiviert wurden, ein erweitertes 3D-Netzwerk von ECM bildeten, das eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Zelladhäsion, -proliferation und -differenzierung spielt in vivo45. Somit kann ein lebendes Knochentransplantat mit einer entwickelten ECM-Mikrostruktur, das in dieser Studie unter In-vitro-Bedingungen hergestellt wurde, die Bildung von neuem Knochen an der Frakturstelle fördern und so die Reparatur und Regeneration des beschädigten Knochens unterstützen.

Raman-Spektroskopie wird häufig in der Forschung zu Biomineralien und in der Biomedizin eingesetzt und liefert strukturelle Einblicke auf mikroskopischer Ebene. Insbesondere seine Fähigkeit, sowohl mineralische als auch organische Stoffe gleichzeitig zu bewerten, wird in der Knochenforschung als vorteilhaft angesehen46,47,48. Die Phasenumwandlung von Hydroxylapatit und die Carbonatsubstitution können mit modernen Raman-Geräten in verschiedenen Aspekten im Mikro- und Nanomaßstab untersucht werden, da nur minimale Vorbereitungen erforderlich sind49,50. Natürlicher Hydroxylapatit ist eine nichtstöchiometrische Struktur, die in die Struktur eingebaute Carbonatgruppen enthält. Carbonationen verringern die Kristallinität und das Kristallwachstum und erhöhen die Löslichkeit von Hydroxylapatit in einer sauren Umgebung, die auf natürliche Weise durch aktive Osteoklasten erzeugt wird, wodurch der biologische Abbau von Hydroxylapatit gefördert wird46,51. Entsprechend der Kristallposition Carbonat wird Apatit in Typ A und Typ B (assoziiert mit OH−- bzw. PO43−-Gruppen)31 unterteilt. Insgesamt ermöglichten Raman-Messungen der mineralischen und organischen Matrix einen Vergleich der ECM-Mineralisierung in zellbesiedelten Biomaterialien, die unter statischen und dynamischen Bedingungen gehalten wurden. Die direkte Umwandlung in amorphes Calciumphosphat wurde nicht beobachtet, aber die kohlensäurehaltige Substitution von Hydroxylapatit vom B-Typ und ein höheres Mineral-zu-Matrix-Verhältnis im mat_R zeigten deutlich, dass der rotierende Bioreaktor effizientere Bedingungen für die Herstellung von Knochenkonstrukten in vitro bot.

HdO-Geräte können viele der Einschränkungen und Komplikationen überwinden, die mit der klinischen Anwendung natürlicher Knochentransplantate verbunden sind. Allerdings stellt die effektive Bildung von lebendem Knochentransplantat in vitro für HdO immer noch eine große Herausforderung dar. In dieser Studie wurde eine vergleichende Analyse verschiedener 3D-Kulturbedingungen unter Verwendung von Perfusion und rotierenden Bioreaktoren vorgestellt, um das effektivste System auszuwählen, das eine günstige Mikroumgebung für die Zellkultivierung bietet und die Erzeugung des Knochenkonstrukts in vitro unterstützt. Die biologische Bewertung und Raman-Analyse von zellbesiedelten Biomaterialien nach 21-tägiger Kultur zeigten, dass der rotierende Bioreaktor (Rotary Cell Culture System, Synthecon) ein besseres Werkzeug zur Herstellung von gewebetechnisch hergestellten Knochentransplantaten für Anwendungen in der regenerativen Medizin ist als der Perfusionsbioreaktor (Lazar Arrow). -MTM Micro Bioreactor System), da es eine überlegene Wirkung auf die zelluläre Reaktion ausübte, beispielsweise durch die Unterstützung der BMDSC-Proliferation, der ECM-Synthese und der Mineralisierung. Wichtig ist, dass die mineralisierte ECM durch eine karbonisierte Substitution von Hydroxylapatit vom B-Typ (assoziiert mit PO43−-Gruppen) und ein höheres Mineral-zu-Matrix-Verhältnis gekennzeichnet war, was eine neu gebildete knochenähnliche Struktur offenbarte. Somit sorgte das rotierende System nicht nur für eine größere Zellbiomasse auf dem Knochengerüst, sondern förderte auch die Bildung gut mineralisierter knochenähnlicher Strukturen. Interessanterweise produzierten die unter statischen Bedingungen kultivierten Zellen (die nur als Testkontrolle dienten) gemäß den ursprünglichen (Roh-)ELISA-Ergebnissen höhere Mengen an osteogenen Markern im Vergleich zu den in beiden Bioreaktoren gezüchteten Zellen. Dennoch ergab die Normalisierung der ELISA-Ergebnisse auf die gesamten zellulären Proteine ​​keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen Gerüsten, die unter statischen Bedingungen und im rotierenden System kultiviert wurden. Darüber hinaus ist zu beachten, dass die Kultivierung von mit Zellen besäten Biomaterialien im rotierenden Bioreaktor es den Zellen ermöglichte, die gesamte Oberfläche des Biomaterials zu überwachsen, was die Knochenbildungskapazität von durch Gewebezüchtung hergestellten Konstrukten steigerte. Im Gegensatz dazu ermöglichte die Kultivierung der Zellen unter statischen Bedingungen die Bildung der knochenähnlichen Struktur nur auf der Oberseite des Biomaterials.

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Diese Forschung wurde vom Nationalen Wissenschaftszentrum (NCN) in Polen im Rahmen des OPUS 22-Stipendiums Nr. finanziert. UMO-2021/43/B/NZ7/00447. Zum Zweck des Open Access haben die Autoren eine öffentliche CC-BY-Urheberrechtslizenz auf alle aus dieser Einreichung resultierenden Author Accepted Manuscript (AAM)-Versionen angewendet. Die Forschung wurde teilweise auch vom polnischen Ministerium für Bildung und Wissenschaft im Rahmen der satzungsgemäßen Tätigkeit der Medizinischen Universität Lublin (Projekt PBmb2/2021) unterstützt. Die Autoren danken Michal Wojcik von der Independent Unit of Tissue Engineering and Regenerative Medicine an der Medizinischen Universität Lublin (Polen) für seine Hilfe bei der konfokalen Mikroskopanalyse.

Unabhängige Abteilung für Tissue Engineering und Regenerative Medizin, Medizinische Universität Lublin, Chodzki 1 Street, 20-093, Lublin, Polen

Paulina Kazimierczak & Agata Przekora

Unabhängige Abteilung für Spektroskopie und chemische Bildgebung, Medizinische Universität Lublin, Chodzki 4a Street, 20-093, Lublin, Polen

Grzegorz Kalisz & Anna Sroka-Bartnicka

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Das Manuskript wurde durch Beiträge aller Autoren verfasst. Alle Autoren haben der endgültigen Fassung des Manuskripts zugestimmt. PK: Konzeptualisierung, Methodik, Ressourcen, Untersuchung, Datenanalyse, Datenvisualisierung; Schreiben – Originalentwurf; GK: Untersuchung, Datenanalyse, Schreiben – Originalentwurf; ASB: Methodik, Ressourcen, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung; AP: Konzeptualisierung, Methodik, Ressourcen, Projektverwaltung, Aufsicht, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung.

Korrespondenz mit Paulina Kazimierczak.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kazimierczak, P., Kalisz, G., Sroka-Bartnicka, A. et al. Wirksamkeit der Herstellung von durch Gewebezüchtung hergestellten lebenden Knochentransplantaten: eine vergleichende Studie unter Verwendung von Perfusions- und rotierenden Bioreaktorsystemen. Sci Rep 13, 13737 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41003-w

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Eingegangen: 24. Mai 2023

Angenommen: 20. August 2023

Veröffentlicht: 23. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41003-w

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